通過式固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和乳粉中4 種類固醇激素

劉 東，李 強(qiáng)，范素芳*，張 巖*

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

類固醇激素是一類四環(huán)脂肪烴化合物[1-2]，包括天然及人工合成的糖皮質(zhì)激素、雌激素等[3]，能促進(jìn)動物超常態(tài)生長[4]，加快奶牛的性成熟，提前達(dá)到泌乳要求，從而大幅度提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，但這些激素在動物體內(nèi)較難分解[5-6]，通過食物鏈進(jìn)入人體后，會導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異?；虼嬖跐撛谥掳?、致畸風(fēng)險[7-9]。因此，世界各國對類固醇激素采取禁用或限用措施[10-11]，但動物源性食品中類固醇激素殘留問題時有發(fā)生，曾一度影響我國動物源性食品的出口量。為保障消費者健康以及我國進(jìn)出口貿(mào)易往來，必須建立靈敏度高、特異性好、可靠的動物源性食品中類固醇激素檢測方法，提高監(jiān)管有效性。

目前，動物源性食品中類固醇激素檢測方法主要有高效液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]。高效液相色譜法靈敏度較差，且無法得到待測物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[17-18]；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法時，待測物需要衍生，耗時較長[19]；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性及特異性好，已成為動物源性食品中類固醇激素殘留測定的首選方法[20-22]。目前，國內(nèi)外已有許多激素檢測的標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)，但大多針對肉制品，乳制品中類固醇激素殘留的檢測方法較少[23-25]，且前處理步驟多采用傳統(tǒng)固相萃取、液-液萃取等，普遍存在步驟繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大等不足[26-28]。本研究采用PRiME HLB固相萃取小柱，可將樣品中的脂肪等干擾物吸附在填料內(nèi)，將目標(biāo)物過濾到進(jìn)樣瓶中，與傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)相比減少活化、淋洗等步驟，簡化了前處理，減少有機(jī)溶劑用量。將該技術(shù)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合，建立牛乳和乳粉中氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇和雌三醇4 種類固醇激素的分析方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，在提高檢測效率的同時保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，建立適用于大批量牛乳和乳粉樣品中4 種類固醇激素的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇、氫化可的松-D2（氫化可的松和乙酸氟氫可的松的內(nèi)標(biāo)，純度大于99.0%）、雌二醇-13C2（雌二醇和雌三醇的內(nèi)標(biāo)，純度大于99.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma公司；超純水 廣州屈臣氏有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX Triple Quad 6500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧電離源） 美國Sciex公司；CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；SHA-B恒溫水浴振蕩搖床 常州潤華電器有限公司；Vortex Genius 3旋渦混合器 德國IKA公司；PRiME HLB固相萃取小柱美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇、氫化可的松-D2、雌二醇-13C2標(biāo)準(zhǔn)品至棕色容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度均為10.0 mg/mL的氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇、氫化可的松-D2、雌二醇-13C2單標(biāo)儲備液，于－20 ℃保存，有效期12 個月。

量取適量氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇、氫化可的松-D2、雌二醇-13C2標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的4 種類固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和2 種內(nèi)標(biāo)混合中間液，于－20 ℃保存，有效期3 個月。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

稱取5 g牛乳或乳粉樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 μL混合內(nèi)標(biāo)中間液，再加入20 mL乙腈（乳粉樣品加入5 mL超純水溶解后再加入20 mL乙腈），渦旋1 min，超聲提取20 min，加入5 g氯化鈉，混勻，9 500 r/min離心2 min，取上層清液，待凈化。

1.3.2.2 凈化

取約3 mL上清液，使其通過PRiME HLB固相萃取小柱并棄去濾液；再取1 mL上清液，再次通過PRiME HLB固相萃取小柱并收集流出液，將收集到的流出液過0.22 μm再生纖維素濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL；流動相A：水，流動相B：乙腈；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～2.0 0 m i n，流動相B體積分?jǐn)?shù)2 0%；2.0 0～4.5 0 m i n，流動相B體積分?jǐn)?shù)20%～80%；4.50～6.00 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)80%；6.00～6.10 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)80%～20%；6.10～7.00 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)20%。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子化電壓－4.5 kV；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力30 psi；霧化器壓力50 psi；輔助氣壓力55 psi。4 種類固醇激素定性離子、定量離子對的MRM參數(shù)如表1所示。

表1 4 種類固醇激素的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters for 4 steroid hormones

1.3.5 結(jié)果計算

氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇含量按下式計算。

式中：X為試樣中各待測組分含量/（μg/kg）；ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算出的樣品溶液中各待測組分質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為試樣溶液最終定容體積/mL；n為試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2 次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[29-31]報道，類固醇激素常用的提取溶劑為叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。本研究考察叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈和甲醇4 種有機(jī)溶劑對氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇和雌三醇的提取效果，結(jié)果表明：甲醇作為提取溶劑時，提取液較渾濁；乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為提取溶劑時，4 種類固醇激素的回收率不及乙腈作為提取溶劑時，且乙腈作為提取溶劑可以很好地去除牛乳和乳粉中的蛋白質(zhì)，故選擇乙腈作為提取溶劑。

PRiME HLB固相萃取小柱可以將牛乳和乳粉中的脂肪等干擾成分去除，延長色譜柱使用壽命，降低基質(zhì)對儀器的污染，提高檢測準(zhǔn)確性，且處理過程簡單、高效，適用于日常大批量樣品的分析檢測。

2.2 色譜條件優(yōu)化

氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇和雌三醇均屬于弱極性高分子質(zhì)量化合物，在C18色譜柱上有較好保留。本研究考察4 種類固醇激素在多種C18色譜柱上的分離效果，包括Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、XBridge BEH Shield RP C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、Thermo AccucoreaQ C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）。結(jié)果表明，Wa t e r s A c q u i t y B E H C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）對4 種類固醇激素的分離效果最好。

對比使用不同流動相（甲醇-水、乙腈-水、10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈）時，4 種類固醇激素的色譜峰峰型和響應(yīng)情況。結(jié)果表明：10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時，雌二醇、雌三醇的檢測靈敏度降低2～3 倍；乙腈-水體系作為流動相時，色譜峰峰型最佳，故選擇該體系作為流動相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

通過流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，將質(zhì)量濃度均為500 ng/mL的氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇、雌三醇、氫化可的松-D2、雌二醇-13C26 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液以5 μL/min流速直接注入Triple Quad 6500質(zhì)譜儀中，采用正/負(fù)離子模式對目標(biāo)物進(jìn)行母離子掃描，對比2 種模式的分離效果。結(jié)果表明：氫化可的松和乙酸氟氫可的松在2 種離子模式下的離子峰強(qiáng)度差別不大，而雌二醇和雌三醇在負(fù)離子模式下的離子峰強(qiáng)度高于正離子峰模式，這是由于雌二醇和雌三醇含有酚羥基結(jié)構(gòu)，易在負(fù)離子模式下獲得[M－H]－，故最終確定采用負(fù)離子模式。在負(fù)離子模式下對目標(biāo)物進(jìn)行Q1 MS全掃描，確定母離子，對母離子進(jìn)行二級掃描，確定定量子離子和定性子離子，再選擇MRM模式，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化條件下目標(biāo)物的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 6 種化合物的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of 6 compounds

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

用乙腈配制一定質(zhì)量濃度范圍的氫化可的松、乙酸氟氫可的松、雌二醇和雌三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，氫化可的松質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，乙酸氟氫可的松和雌三醇質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，雌二醇質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 ng/mL，按優(yōu)化所得儀器條件進(jìn)行測定，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法確定方法檢出限和定量限，信噪比為3和10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別作為檢出限和定量限。

表2 4 種類固醇激素的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Calibration curve equations, limits of detection and limits of quantification of 4 steroid hormones

由表2可知，4 種類固醇激素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)≥0.999，檢出限為0.4～2.0 μg/kg，定量限為0.8～4.0 μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收率

表3 4 種類固醇激素的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and precision (RSD) of the 4 steroid hormones from spiked samples (n= 6)

在空白牛乳和乳粉基質(zhì)中添加4 種類固醇激素進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，共添加3 個水平，每個水平重復(fù)6 次。由表3可知，4 種類固醇激素在牛乳基質(zhì)中加標(biāo)回收率為87.7%～110.8%，RSD為0.85%～4.56%，在乳粉基質(zhì)中加標(biāo)回收率為89.2%～107.4%，RSD為1.22%～4.22%。

3 結(jié) 論

建立通過式固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛乳和乳粉中4 種類固醇激素，樣品經(jīng)乙腈提取后，采用PRiME HLB固相萃取小柱凈化，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合內(nèi)標(biāo)法校正。該方法前處理提取率高，條件易于控制，方法靈敏度高，重復(fù)性好，適用于牛乳和乳粉中4 種類固醇激素的檢測，也可為其他動物源性食品中其他類固醇激素含量的測定提供參考。