麻城黑山羊MC4R基因遺傳多態(tài)性及生物信息學分析

郭帥，楊娟，劉詩雨，楊豐利，熊琪，汪招雄

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

MC4R（melanocortin receptor-4）是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，一種肽類物質(zhì)，分泌部位在哺乳動物的下丘腦內(nèi)側(cè)核。不僅存在于下丘腦，還廣泛存在于大腦皮質(zhì)、丘腦、腦干和脊索等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中［1］。MC4R在大腦的食欲調(diào)節(jié)區(qū)域參與瘦素信號傳遞，是調(diào)節(jié)能量動態(tài)平衡的重要信號分子。MC4R能與內(nèi)源性配體黑色素細胞刺激素（alpha melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）、刺鼠蛋白（agouti-signaling peptide，ASIP）及其相關(guān)蛋白（Agoutirelated proteins，AGRPs）結(jié)合［2］。α-MSH是阿片-促黑素細胞皮質(zhì)素原（Proopiomelanocortin，POMC）的分解產(chǎn)物，為MC4R的內(nèi)源性激動劑。ASIP及AGRPs等由外周神經(jīng)元細胞合成，是MC4R的內(nèi)源性拮抗劑［3］。MC4R通過與激動劑、拮抗劑的互作來控制食欲和維持體態(tài)。敲除MC4R基因小鼠表現(xiàn)出采食量增加、脂肪沉積變快以及胰島素過量分泌等特征［4］。

研究表明，MC4R基因是豬、牛、雞等畜禽重要經(jīng)濟性狀的候選基因［5］。豬MC4R基因與脂肪性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，與豬胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌寬度、眼肌面積、皮率呈顯著相關(guān)［6］。牛MC4R基因與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，與秦川牛背膘厚顯著相關(guān)［7］。雞MC4R不同基因型也與體重、全凈膛重、腿肉重等存在顯著或極顯著相關(guān)［8］。

麻城黑山羊是湖北省優(yōu)良地方山羊品種，具有毛色純黑，耐粗飼，繁殖能力強，遺傳性能穩(wěn)定等特點［9］。目前，關(guān)于麻城黑山羊MC4R基因遺傳多樣性及其功能的研究還未見報道。本研究通過基因測序，尋找麻城黑山羊MC4R的多態(tài)位點，并利用生物信息學方法，分析預測其結(jié)構(gòu)和功能，為進一步研究MC4R基因及其自然突變體調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導及影響麻城黑山羊生長代謝的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及血液DNA提取

30只麻城黑山羊樣本采自湖北金旸（麻城）畜牧有限公司。山羊頸靜脈采血5 mL至肝素鈉抗凝管。采用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取血液基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計及PCR擴增

根據(jù)NCBI中山羊MC4R基因序列（GenBank登陸號為NM_001285591.1），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物（表1），交由武漢奧科生物公司合成。PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，其中混合DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，35個循環(huán)，最后72℃終延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送武漢奧科生物公司測序。

表1 麻城黑山羊MC4R基因擴增引物序列信息

1.3 多態(tài)性位點分析

利用DNAStar軟件的SeqManⅡ程序，將測序結(jié)果與MC4R基因參考序列進行分析比對，掃描SNPs位點。

1.4 等位基因頻率估算

將SNPs位點峰圖上傳至MWSnap應(yīng)用軟件進行峰值測量，帶入公式對等位基因頻率進行估算［10］。

式中，?i表示SNP位點等位基因的頻率；hi表示測序圖上等位基因1或2峰值。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 理化性質(zhì)分析及疏水性結(jié)構(gòu)預測 使用Ex-PAsY Protparam軟件對MC4R蛋白的相對分子質(zhì)量（MW）和等電點（PI）等進行預測；使用在線軟件ProtScale對MC4R蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)進行預測。

1.5.2 MC4R的亞細胞定位、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預測 使用SignalIP 5.0版本軟件對信號肽進行預測分析，使用SubLoc V1.0軟件對MC4R亞細胞定位情況進行分析；使用TMHMM Server軟件對MC4R蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預測。

1.5.3 預測蛋白的糖基化位點和磷酸化位點 使用NetNGlyc在線軟件來預測麻城黑山羊MC4R蛋白的N-糖基化位點；使用NetOGlyc-4.0版本在線軟件預測麻城黑山羊MC4R蛋白的O-糖基化位點；使用Net Phos 3.1版本在線軟件來預測黑山羊MC4R蛋白的磷酸化位點。

1.5.4 二級結(jié)構(gòu)預測 使用Predictprotein在線工具預測MC4R蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.5.5 系統(tǒng)進化樹 下載綿羊、牛、豬、雞、犬等物種的MC4R氨基酸序列，與麻城黑山羊MC4R氨基酸序列一起上傳到NCBI中的Blast在線軟件進行多重序列比對，用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析MC4R蛋白序列在不同物種間的進化情況。

1.5.6 結(jié)構(gòu)域及功能位點預測 使用STRING在線軟件對MC4R蛋白結(jié)構(gòu)域的功能位點進行預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻城黑山羊MC4R基因的克隆

以混合DNA樣本為模板擴增MC4R基因CDS區(qū)序列，通過凝膠電泳來檢測擴增產(chǎn)物（圖1）。由圖1可知，PCR擴增條帶明亮，擴增出約1 000 bp的片段，與預測結(jié)果相符。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 麻城黑山羊MC4R基因多態(tài)位點掃描

麻城黑山羊混池測序結(jié)果表明，在MC4R基因中共檢測到8個突變位點（圖2）。

圖2 麻城黑山羊MC4R突變位點

2.3 麻城黑山羊MC4R的等位基因頻率估算及突變類型分析

使用李平等［10］等位基因頻率估算的方法，用MWSnap軟件測量所有突變位點等位基因的峰高，并根據(jù)公式計算等位基因頻率。突變類型分析發(fā)現(xiàn)，麻城黑山羊MC4R基因第649號位點和第784號位點為同義突變，沒有導致氨基酸變化；其余突變位點為錯義突變，氨基酸變化詳見表2。

表2 麻城黑山羊MC4R基因的SNPs等位基因頻率

2.4 麻城黑山羊MC4R蛋白的理化性質(zhì)分析和疏水性結(jié)構(gòu)預測

MC4R蛋白的分子式為C1664H2619N413O454S24，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為36 443.55 g/mol，理論等電點（PI）為7.52。MC4R氨基酸序列中亮氨酸（Leu）含量最多，占氨基酸總量的11.4%，色氨酸（Trp）含量最少，占氨基酸總量的0.9%，沒有吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。正、負電荷殘基數(shù)分別為16、17。不穩(wěn)定系數(shù)為47.86（＞45為不穩(wěn)定），提示MC4R為不穩(wěn)定蛋白。蛋白親水性為0.778，說明MC4R為疏水蛋白。用ProtScale進一步對麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)進行預測分析（圖3），其親水性/疏水性最小值為-1.967，最大值為3.367，總體表現(xiàn)為疏水性，與前面的親水性分析相互驗證。

圖3 麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)

MC4R的8個突 變位點 中有2個即C617A和C649G，使蛋白質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生變化。突變后的相對分子質(zhì)量變?yōu)?6 488.04，理論PI值變?yōu)?.09，正電荷殘基數(shù)目變?yōu)?7，仍然為不穩(wěn)定疏水性蛋白。其余6個突變體的理化性質(zhì)、蛋白親水性/疏水性值均未發(fā)生變化。

2.5 麻城黑山羊MC4R的亞細胞定位、信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)分析

預測MC4R蛋白定位于細胞膜，其有信號肽的可能性較?。?.309%）。所有突變體的信號肽及亞細胞定位預測結(jié)果未見明顯變化，說明突變體可能不會引起MC4R蛋白信號肽及細胞定位的改變。

跨膜結(jié)構(gòu)螺旋區(qū)對蛋白質(zhì)功能的作用非常重要。分析MC4R蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，MC4R蛋白有7個跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜轉(zhuǎn)運蛋白（圖4）?？缒て畏植家姳?。所有突變體的跨膜結(jié)構(gòu)沒有明顯改變。

圖4 麻城黑山羊MC4R跨膜區(qū)

表3 跨膜片段信息

2.6 麻城黑山羊MC4R的糖基化位點以及磷酸化位點預測

麻城黑山羊MC4R的N-糖基化位點預測結(jié)果見圖5，可能有5個N-糖基化位點，分別位于第2、17、26、97、108位的天冬酰胺殘基，表明MC4R蛋白可能具有N-糖基化機制。O-糖基化位點預測結(jié)果見圖6，共有10個O糖基化位點，說明MC4R蛋白可能具有O-糖基化機制。磷酸化位點預測結(jié)果見圖7，發(fā)現(xiàn)20個絲氨酸位點，6個蘇氨酸位點，1個賴氨酸位點，其對應(yīng)激酶見表4。突變體的蛋白糖基化、磷酸化位點與野生型未見不同。

圖5 N-糖基化位點預測

圖6 O-糖基化位點預測

圖7 磷酸化位點預測

表4 磷酸化位點對應(yīng)激酶

2.7 麻城黑山羊MC4R蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測分析

麻城黑山羊MC4R蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖8，黑色為α螺旋，藍色為β折疊，紅色為無規(guī)則卷曲。其中α螺旋占53.7%，β折疊占6.2%，無規(guī)則卷曲占0.8%。對麻城黑山羊8個MC4R突變體的二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，C617A、C649G兩個突變體的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，C617A突變體α螺旋變?yōu)?6.6%，β折疊變?yōu)?.33%、無規(guī)則卷曲變?yōu)?.37%，其余6個突變體對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)無變化。

圖8 麻城黑山羊MC4R二級結(jié)構(gòu)預測

2.8 構(gòu)建麻城黑山羊MC4R蛋白的系統(tǒng)進化樹

利用NCBI中綿羊、人、豬、犬、牛等物種的MC4R氨基酸序列及麻城黑山羊MC4R氨基酸序列進行多重比對，構(gòu)建不同物種的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖9。由圖9可知，麻城黑山羊MC4R氨基酸序列與綿羊的相似性為97.82%，與牛的相似性為94.50%，說明MC4R是保守蛋白，且麻城黑山羊與綿羊的MC4R處于一個分支，與牛的親緣關(guān)系較近，與雞的親緣關(guān)系最遠。

圖9 不同物種MC4R蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.9 MC4R蛋白的互作蛋白預測

在STRIG交互式數(shù)據(jù)庫中搜索可能與MC4R蛋白相互作用的蛋白時發(fā)現(xiàn)，MC4R蛋白與POMC、NPS、IAPP、GCG、AGRP、GLP1R、GNB3、GIPR、CRHR1、CRH可能存在相互作用。

圖10 麻城黑山羊MC4R蛋白相互作用的蛋白預測

3 小結(jié)與討論

作為促腎上腺皮質(zhì)素的受體，MC4R可介導腎上皮質(zhì)腺類固醇的合成，參與其代謝及信號轉(zhuǎn)導過程，在調(diào)控糖脂代謝和胰島素分泌方面發(fā)揮重要作用。MC4R基因變異與人類較低的內(nèi)臟脂肪積累和較高的餐后碳水化合物利用率具有關(guān)聯(lián)性［11］。敲除MC4R基因的小鼠，患有食欲亢進和肥胖［12］。MC4R還與葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)［13］，大鼠MC4R缺乏會使葡萄糖代謝累加，導致糖尿病［14］。MC4R可以與一些配體結(jié)合發(fā)揮調(diào)控體脂代謝的作用。如MC4R可以與天然內(nèi)源配體α-MSH結(jié)合，從而抑制體重的增加［2］。MC4R還能高親和地與外源藥物激動劑setmelanotide結(jié)合，為瘦素受體缺陷型患者提供持久的減肥［15］。

MC4R基因在調(diào)控畜禽生長發(fā)育方面的研究較多。在杜洛克和地方品種豬雜交配種群中，MC4R基因影響脂肪酸的組成［6］。綿羊MC4R基因G1232A突變影響出生體重、斷奶體重和脂肪厚度［16］，G1232A突變與背膘厚度顯著相關(guān)［17］。MC4R是影響雞早期生長和肌肉性狀的主效基因［18］，不同MC4R基因型與雞體重極顯著相關(guān)［8］。江香豬G1392A突變導致精氨酸變?yōu)榻M氨酸，影響豬生長性狀和背膘厚度［19］。秦川牛A129G突變影響?；钪兀珻1069G突變與活重、屠體重、背膘厚、大理石紋顯著相關(guān)［7］。MC4R基因的多態(tài)性在育種過程中有潛在應(yīng)用價值，是非常重要的分子標記。

麻城黑山羊MC4R基因有999 bp的完整CDS，編碼332個氨基酸，與綿羊的序列相似性達到97.82%。MC4R的互作蛋白主要有AGRP、CRHR1、GLP1R、GCG等，其中AGRP是機體內(nèi)維持代謝穩(wěn)態(tài)和能量平衡的重要神經(jīng)元，對調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝率、攝食、脂肪和糖代謝起重要作用［20］；GLP1R是胰高血糖素樣肽1受體，與cAMP信號通路、胰島素分泌有關(guān)［21］；GCG是胰高血糖素，與胰島素分泌、胰高血糖素信號通路有關(guān)［22］。因此，作為重要的配體，MC4R基因與血糖升高、體脂肪變化、能量代謝有密切關(guān)系［23］。本研究發(fā)現(xiàn)MC4R基因在麻城黑山羊中存在8個突變位點，并且C617A位點突變后會引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)以及蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。后期將針對這些突變位點，深入研究其配體結(jié)合能力、信號轉(zhuǎn)導功能，開展性狀關(guān)聯(lián)分析，闡明不同MC4R突變體對麻城黑山羊生長性狀的影響。

研究成功克隆麻城黑山羊MC4R基因序列，獲得了8個MC4R突變位點。生物信息學分析結(jié)果顯示，麻城黑山羊MC4R基因在哺乳動物中保守性較強。其理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)功能預測表明MC4R基因及其突變體很有可能參與麻城黑山羊血糖調(diào)控，體脂變化、能量代謝等生長代謝過程。