白術(shù)腋芽離體快繁技術(shù)初探

李紅英，陳菲菲，殷紅清，覃大吉，孫舉志，楊永康，向極釬，李亞杰

（1.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北省富硒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 恩施 445000）

白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz.）是一種名貴中藥材，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效［1-7］。近年來，白術(shù)藥材應(yīng)用廣泛，市場需求大，但白術(shù)品種嚴(yán)重退化，生產(chǎn)周期長，土壤不能連續(xù)利用，只能輪作，給栽培帶來許多困擾。導(dǎo)致白術(shù)藥材產(chǎn)量與質(zhì)量嚴(yán)重下降，無法滿足市場需求。鑒于此，本試驗(yàn)采用無菌優(yōu)良白術(shù)種苗（生產(chǎn)上表現(xiàn)好的一類型Ⅱ［8］）為外植體，開展組培快繁技術(shù)與提純復(fù)壯研究工作，得到一種優(yōu)良、穩(wěn)定、健壯的新品種，促進(jìn)了白術(shù)次生代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)［9，10］，進(jìn)一步縮短了生產(chǎn)周期，擴(kuò)大繁殖系數(shù)，改善白術(shù)藥材的生產(chǎn)現(xiàn)狀，為白術(shù)新品種選育技術(shù)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以無菌培養(yǎng)體系中白術(shù)優(yōu)勢種群、優(yōu)良單株、健壯、幼嫩的白術(shù)苗為外植體，根據(jù)外植體的大小和腋芽的多少將其修剪成1.0～2.5 cm長的一葉一芽的小腋芽，每株可修剪成3～5個(gè)小腋芽，置于培養(yǎng)皿中。

1.2 方法

1.2.1 叢生芽分化誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基的篩選 使用經(jīng)過高壓滅菌的醫(yī)用鑷子、醫(yī)用剪刀，將處理好的小腋芽按每瓶一個(gè)直接接種到裝有叢生芽分化誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基支撐墊（腋芽托，其中所用培養(yǎng)瓶為圓柱形的300 mL玻璃瓶，每瓶裝60～80 mL液體培養(yǎng)基，液面上加一個(gè)支撐墊，接種時(shí)支撐墊的一半浸在叢生芽分化誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中。下同）上：1/2 MS、1.0～2.0 mg/L 6-BA、0.4～0.8 mg/L NAA、0.1～0.5 mg/L IBA、0.2～0.6 mg/L GA3、35～50 g/L蔗糖，pH 5.8～6.0，并于光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)10～15 d，應(yīng)用L（934）正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2 對分化誘導(dǎo)形成的叢生芽進(jìn)行生長培養(yǎng) 在超凈工作臺上，將分化誘導(dǎo)形成的叢生芽培養(yǎng)到1～2 cm后，將原有培養(yǎng)基吸出，灌入生長液體培養(yǎng)基：MS+20～40 g/L蔗糖，每瓶裝80～100 mL，支撐墊的一半浸在液體生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)11～15 d即可長滿瓶。

1.2.3 對生長培養(yǎng)的叢生芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基篩選 在超凈工作臺上，將培養(yǎng)的叢生芽修剪成1～2 cm長的小腋芽，按每瓶1～5芽轉(zhuǎn)接到生根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中：1/4 MS、0.1～0.7 mg/L NAA、0.2～0.5 mg/L IBA，蔗糖30～50 g/L，pH 5.8～6.0。于光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～12 d后，以30株為一組，每組3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 對生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的叢生芽進(jìn)行壯苗培養(yǎng) 在超凈工作臺上，待新根長出0.5～1.5 cm時(shí)，將叢生芽誘導(dǎo)生根液體培養(yǎng)基吸出，再灌入壯苗液體培養(yǎng)基：MS+20～40 g/L蔗糖，pH 5.8。并于光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～10 d。

1.3 煉苗移栽

對通過壯苗培養(yǎng)的叢生芽進(jìn)行煉苗處理（敞瓶煉苗、基質(zhì)煉苗）；將生根壯苗培養(yǎng)基置于煉苗室常溫閉瓶煉苗0～3 d，旋松生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶蓋0～2 d，全開瓶蓋1～3 d；敞瓶煉苗完成后將白術(shù)苗置于清水中，洗去根部培養(yǎng)液，撈出，移栽至裝有泥炭土∶珍珠巖按2∶1比例配成的混合物穴盤基質(zhì)中，每2 d噴水1次，3 d后噴施1 g/L的多菌靈或甲基托布津，隔5 d再噴施1次以防病菌。15 d后逐漸減少噴水的次數(shù)，并定期噴施一次組分為1/8 MS的營養(yǎng)液，生長20～30 d，待有新生根系將基質(zhì)包裹，形成穩(wěn)定的根系基質(zhì)系統(tǒng)，即可定植于富含腐殖質(zhì)的沙質(zhì)土壤中。以300株為一組，分為5組，培養(yǎng)20 d后分別統(tǒng)計(jì)成活率。成活率為95%以上。

1.4 苗圃移栽和管理

生產(chǎn)白術(shù)栽子（白術(shù)種苗）：將4—6月移栽至苗圃的白術(shù)叢生芽苗，返青期間（移栽30～40 d）進(jìn)行適當(dāng)遮陽，10 d澆水一次，15 d噴施一次1 g/L多菌靈以防病菌，返青期后，去掉遮陽設(shè)備，在白術(shù)叢生芽苗的行間施一定量的農(nóng)家肥，進(jìn)行人工除草，按照白術(shù)種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程（DB42/T 328—2005）的要求進(jìn)行栽培管理。10月下旬到11月上旬起挖根莖，勿傷主芽和根狀莖表皮，置室內(nèi)通風(fēng)處攤放5～10 d，待外皮發(fā)白時(shí)，貯藏待種。以50株為一組，分別以5組試驗(yàn)為對比，分析白術(shù)組培苗與種子苗的產(chǎn)量。

1.5 白術(shù)栽子進(jìn)行分級和包裝

將所得典型白術(shù)優(yōu)勢種群的種苗，依據(jù)白術(shù)種苗等級標(biāo)準(zhǔn)，按根莖重、根數(shù)、根莖直徑和感觀指標(biāo)分為一、二、三等。進(jìn)行分級和包裝。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)腋芽分化誘導(dǎo)液體培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)因素和水平及結(jié)果見表1和表2，腋芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)4～10 d后，觀察到腋芽開始生長分化；經(jīng)分化誘導(dǎo)25 d后，平均每瓶可長出3.0～5.5個(gè)叢生芽，每個(gè)叢生芽可修剪成3～5個(gè)小腋芽，增殖倍數(shù)為9.0～27.5。由R1的大小可知，影響白術(shù)叢生芽增殖率依次為B＞D＞C＞A，由R2的大小可知，影響白術(shù)叢生芽增值倍數(shù)依次為D＞B＞C＞A；9組試驗(yàn)中只有第四組試驗(yàn)所得白術(shù)叢生芽增殖率與增殖倍數(shù)最佳。因此，得到最優(yōu)白術(shù)腋芽分化誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基的植物生長素為A2B1C2D3，即1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA+0.6 mg/L GA3為白術(shù)腋芽分化誘導(dǎo)較為理想的培養(yǎng)基。此條件下白術(shù)腋芽叢生芽增殖率高達(dá)97.3%，增殖倍數(shù)為16。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平 （單位：mg/L）

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2 叢生芽生根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基篩選結(jié)果

結(jié)果見表3，將培養(yǎng)到2 cm左右的白術(shù)叢生芽剪切后轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～6 d后，觀察到新根長出。4～10 d后觀察到根和芽開始生長，培養(yǎng)20 d后，平均生根數(shù)為6～8根/芽，生長素NAA和IBA共同作用能促進(jìn)白術(shù)試管苗快速生根，但是生長素濃度大小差異明顯，生根效果以1/4 MS+0.2 mg/L IBA+0.4 mg/L NAA最佳，濃度過高時(shí)根容易形成餅狀畸形，濃度過低生根時(shí)間較長，生根率較低。

表3 植物生長素誘導(dǎo)叢生芽生根效果，以1/4 MS為基礎(chǔ)

2.3 移栽試驗(yàn)結(jié)果

試管苗移栽較適空氣濕度保持在75%～85%，遮光率40%，環(huán)境溫度控制在20～26℃，定期噴施營養(yǎng)液，并加強(qiáng)移栽后管理，定時(shí)噴施殺菌劑，做好防霉防病工作。4—6月常溫下均可移栽，20 d后，統(tǒng)計(jì)成活率為94%以上。

2.4 白術(shù)栽子苗與種子栽子苗的比較

通過對組培苗規(guī)范性管理，所得的白術(shù)無性種苗大小均勻，皆是典型白術(shù)優(yōu)勢種群Ⅱ的種苗類型，無畸形，組培苗一年生種苗平均單株重是咸豐白術(shù)種子種苗的3.37倍，明顯優(yōu)于種子種苗（表4）。

表4 白術(shù)種子種苗與組培苗產(chǎn)量比較（單位：g）

2.5 對苗圃生產(chǎn)的白術(shù)栽子進(jìn)行分級和包裝

按照白術(shù)種苗等級標(biāo)準(zhǔn)，將白術(shù)栽子劃分為一、二、三等，其中一等為80%，二等為15%，三等為5%。可見組培苗生產(chǎn)出的白術(shù)栽子80%以上為上等，大大提高了種苗的質(zhì)量與產(chǎn)量。增加了育苗的新途徑，加大了種苗的育種進(jìn)程。

3 小結(jié)

白術(shù)類型Ⅱ作為優(yōu)良單株繁殖的無菌體系，不僅在試管苗階段既能保持較好的遺傳品質(zhì)和母體遺傳的穩(wěn)定性，又能將優(yōu)良品種應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，因此，白術(shù)類型Ⅱ可選為無菌體系外植體。

6-BA、NAA、IBA、GA34種植物生長調(diào)節(jié)素相互作用共同促進(jìn)白術(shù)腋芽誘導(dǎo)分化的形成培養(yǎng)，加上運(yùn)用植物液體培養(yǎng)條件，大大提高了白術(shù)的繁殖系數(shù)和縮短了白術(shù)擴(kuò)繁的生長周期，每個(gè)周期可以擴(kuò)大上萬倍的試管苗，如果外界條件允許，比如建有保溫大棚等，每個(gè)季節(jié)都可以移栽試管苗，再不受季節(jié)的影響，隨時(shí)都有白術(shù)苗出售，這為育種和生產(chǎn)過程中保存和利用優(yōu)質(zhì)中間體材料提供了科學(xué)的依據(jù)，克服了種子繁殖后代性狀嚴(yán)重分離的現(xiàn)象，也縮短了白術(shù)品種選育年限。

生長素IBA、NAA共同促進(jìn)白術(shù)試管苗根的生長，大約轉(zhuǎn)接4 d后生根，根系生長發(fā)達(dá)旺盛，大約21 d便可以移栽，不受季節(jié)的影響，而原來單獨(dú)利用NAA生長素促進(jìn)白術(shù)根的生長，受到植株季節(jié)的影響，春季生長快速，但是夏、秋、冬三個(gè)季節(jié)生長卻很緩慢，甚至停止生長。這個(gè)突破點(diǎn)，為白術(shù)藥材品質(zhì)的篩選奠定了一定的基礎(chǔ)。