攀枝花市沙門菌臨床分離株血清型和分子分型特征分析

陳 嫣， 崔 琳， 黃偉峰， 封正娟， 劉 玥， 許學(xué)斌

（1. 攀枝花市疾病預(yù)防控制中心，四川 攀枝花 617000；2. 上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126；3. 四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610000；4. 上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

目前，沙門菌（Salmonella）已經(jīng)成為影響人類健康的重要生態(tài)行為傳染病病原菌之一，其血清型有2 659個(gè)，依據(jù)臨床癥狀分為自限型、腸道腹瀉型和腸外侵襲型，暴露因素以食源性和養(yǎng)殖寵物等常見(jiàn)[1-2]。非傷寒沙門菌導(dǎo)致的散發(fā)與暴發(fā)疾病在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家屬首位疾病負(fù)擔(dān)的食源性疾病，該菌亦是我國(guó)公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域最常見(jiàn)的食源性致病菌[2]。攀枝花市于2018年入選國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)的省屬監(jiān)測(cè)點(diǎn)，基于優(yōu)化的沙門菌臨床病例監(jiān)測(cè)和定點(diǎn)醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室確診病例，通過(guò)菌株表型復(fù)核、耐藥與分子分型特征分析，初步掌握本地區(qū)沙門菌血清型和耐藥與分子流行基線特征，為應(yīng)對(duì)潛在的食源性或侵襲性散發(fā)、暴發(fā)疫情提供生物背景和溯源樣本參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2018—2019年攀枝花市4家哨點(diǎn)醫(yī)院基于優(yōu)化監(jiān)測(cè)方案培訓(xùn)與病例的90株沙門菌臨床分離株，其中分離自腸道感染性腹瀉病例79株、腸外散發(fā)感染性病例11株（血流散發(fā)9株、傷口1株、尿液1株），菌株經(jīng)攀枝花市疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定確認(rèn)。體外藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和分子分型質(zhì)控菌株布倫登盧普沙門菌（H9812）由攀枝花市疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室自行保存。

1.2 試劑和儀器

亞硝酸鹽煌綠增菌液、1型抗原誘導(dǎo)培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、沙門菌顯色瓊脂平板和腸道菌篩選雙糖管（上海安科生物制品有限公司）；沙門菌分型血清60種和適配誘導(dǎo)血清（丹麥SSI診斷公司）；14種抗菌藥物定量檢測(cè)板CHNMCMM（美國(guó)賽默飛世爾公司）；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ（英國(guó)Biolabs公司）；低熔點(diǎn)瓊脂糖、CHEF Mapper脈沖凝膠電泳儀和Gel DocXR凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀、菌液比濁儀（法國(guó)生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 沙門菌血清型和臨床病例特征 收集90例沙門菌感染病例臨床流行病學(xué)特征數(shù)據(jù)，按腸道內(nèi)和腸道外感染病例進(jìn)行分類，將原發(fā)或繼發(fā)性血液（流）或體液感染病例定義為侵襲性沙門菌型；按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的沙門菌O&H抗原標(biāo)準(zhǔn)化鑒定流程進(jìn)行菌株血清型復(fù)核，基于同行驗(yàn)證，并通過(guò)我國(guó)已公開的沙門菌型數(shù)據(jù)庫(kù)與國(guó)內(nèi)、省內(nèi)的沙門菌新菌型進(jìn)行比對(duì)[2-3]。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 按照我國(guó)國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)技術(shù)方案測(cè)試90株沙門菌對(duì)14種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢他啶、氨芐西林-舒巴坦、亞胺培南、四環(huán)素、萘啶酸、頭孢西丁、氯霉素、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、氨曲南、環(huán)丙沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑）的耐藥性。折點(diǎn)判斷依據(jù)2019年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)（耐藥率包含耐藥和中介菌株）[4]。多重耐藥菌（multiple-drug resistance，MDR）定義：至少同時(shí)耐3種和（或）以上不同類型抗菌藥物；ACT/S：耐氨芐西林（A）-氯霉素（C）-復(fù)方磺胺甲噁唑；ACT/ST：耐氨芐西林（A）-氯霉素（C）-復(fù)方磺胺甲噁唑（T/S）-四環(huán)素（T）。采用χ2檢驗(yàn)（P<0.05）比較不同菌型菌株的耐藥率。

1.3.3 分子分型 按照國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)統(tǒng)一的沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）參數(shù)對(duì)90株沙門菌進(jìn)行分子分型和圖譜分析。以H9812為質(zhì)量對(duì)照，限制性內(nèi)切酶為XbaⅠ，37 ℃酶切2 h、電泳時(shí)間19 h。膠塊用GelRed染料（美國(guó)Biotium公司）染色30 min，用純水脫色60 min，圖譜經(jīng)成像儀和BioNumerics（6.5）分析軟件作聚類與分析，聚類圖類型根據(jù)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法構(gòu)建，要求最優(yōu)化值為0.5%，條帶位置差異容許度為1.0%。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌感染病例的臨床流行病學(xué)特征

2018年9月—2019年8月，攀枝花市4家哨點(diǎn)醫(yī)院90例沙門菌感染病例中，腸道腹瀉型和腸外侵襲型病例分別為79例（87.78%，79/90）和11例（12.22%，11/90）。沙門菌感染病例的三間分布特征顯示，男性病例明顯多于女性（性別比為55∶35）；病例年齡分布：<5歲（29例）、5～19歲（11例）、20～59歲（29例）、≥60歲（21例），病例相對(duì)集中在<5歲和成年人中；腸道腹瀉病例發(fā)病時(shí)間在2019年春夏季（尤其在5～7月）存在月度峰值（7月的腹瀉病例數(shù)接近20例），平均月度腹瀉病例超過(guò)10例；腸外侵襲型病例沒(méi)有明顯季節(jié)性，有2例腸炎沙門菌感染病例（17歲和76歲男性各1例）同時(shí)在其糞便和血液中分離到腸炎沙門菌。

2.2 沙門菌血清型特征

90株沙門菌臨床分離株經(jīng)O&H抗原鑒定，有15種血清型，分布于A、B、C、D、E、H 6個(gè)群，以B群（56.70%）和D群（26.70%）的病例最多，居前5位的血清型分別為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌、倫敦沙門菌和韋太夫雷登沙門菌。侵襲性血清型包括腸炎沙門菌（6株）、甲型副傷寒沙門菌（2株）、鼠傷寒沙門菌（1株）、德比沙門菌（1株）和烏撒拉茂沙門菌（1株），其中烏撒拉茂沙門菌經(jīng)同行驗(yàn)證和攀枝花市醫(yī)學(xué)情報(bào)站查新確認(rèn)，屬國(guó)內(nèi)首次分離的侵襲性沙門菌血清型。見(jiàn)表1。

表1 90株沙門菌臨床分離株血清型分布

2.3 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

90株沙門菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率居前3位的依次為環(huán)丙沙星（64.44%）、頭孢唑啉（63.33%）、萘啶酸（60.00%）；MDR所占比例達(dá)48.89%；對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、三代頭孢（頭孢他啶和頭孢噻肟）、亞胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷類（慶大霉素）仍高度敏感。46株鼠傷寒沙門菌和24株腸炎沙門菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、四環(huán)素、萘啶酸、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑等7種抗菌藥物耐藥和MDR構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有5株鼠傷寒沙門菌為ACT/S和ACT/ST耐藥型，而腸炎沙門菌無(wú)此耐藥型；腸炎沙門菌耐藥特征為高耐氟喹諾酮類和氨芐西林，對(duì)頭孢噻肟的耐藥率（20.83%）高于鼠傷寒沙門菌（8.70%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。腸外的2株甲型副傷寒沙門菌除對(duì)萘啶酸耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星中介外，對(duì)其他抗菌藥物均敏感。

表2 90株沙門菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率 %

2.4 分子分型

90株沙門菌經(jīng)過(guò)PFGE、圖譜聚類分析，整合包括血清型、耐藥表型等多維信息，確認(rèn)血清型明顯優(yōu)勢(shì)的鼠傷寒沙門菌存在3個(gè)不同程度的流行克?。?個(gè)為MDR克?。?9例）、1個(gè)為敏感克隆（18例），2個(gè)MDR克隆間的遺傳相似度較高；腸炎沙門菌存在1個(gè)高度同源、對(duì)氨芐西林（氨芐西林-舒巴坦）和氟喹諾酮（萘啶酸和環(huán)丙沙星）高耐藥的MDR流行克?。?1株）；3株倫敦沙門菌為典型MDR克?。?株斯坦利沙門菌對(duì)抗菌藥物完全敏感，且感染者發(fā)病時(shí)間相同，其中2株為同源性克??；2株韋太夫雷登沙門菌對(duì)抗菌藥物敏感，亦有同源性克隆特征。分子分型結(jié)合耐藥特征結(jié)果顯示，90株沙門菌前5種優(yōu)勢(shì)血清型存在1個(gè)或多個(gè)典型的流行克隆。見(jiàn)圖1。

圖1 90株沙門菌PFGE聚類分析結(jié)果（限制性內(nèi)切酶XbaⅠ）

3 討論

致病菌識(shí)別網(wǎng)是我國(guó)參考發(fā)達(dá)國(guó)家主動(dòng)監(jiān)測(cè)食源性病原菌網(wǎng)絡(luò)建立的傳染病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（PulseNet China）的升級(jí)版，但其本質(zhì)還是被動(dòng)監(jiān)測(cè)。攀枝花市地處我國(guó)西南，毗鄰長(zhǎng)江上游，氣候適宜，平均溫度為20 ℃，居住人口約120萬(wàn)，經(jīng)濟(jì)水平位居四川省前列，自2018年加入監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)后，基于醫(yī)防結(jié)合促進(jìn)臨床實(shí)驗(yàn)室掌握沙門菌分離和鑒定的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)，通過(guò)結(jié)果共享提升傳染病網(wǎng)報(bào)精度，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了國(guó)內(nèi)首例食源性暴露后繼發(fā)血流感染的烏撒拉茂沙門菌（SalmonellaUzaramo）的罕見(jiàn)病例，促進(jìn)了醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)臨床沙門菌感染診療技能的重視度[6-7]。

本研究4家哨點(diǎn)醫(yī)院的沙門菌感染病例反映了本地區(qū)沙門菌腸內(nèi)和腸外感染特征。腹瀉型優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、倫敦沙門菌、斯坦利沙門菌、韋太夫雷登沙門菌，流行峰值在春夏季，男性病例多于女性，以<5歲幼兒（行為暴露）和20～59歲成人（食源性暴露）為主；侵襲性感染的優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門菌、甲型副傷寒沙門菌，無(wú)季節(jié)發(fā)病特征。本地區(qū)腹瀉菌型特征與我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)較一致：上海的鼠傷寒沙門菌低年齡組散發(fā)病例具明顯優(yōu)勢(shì)（尤其在2012年之后），腸炎沙門菌在成年人組占優(yōu)，符合食源性暴露特征[8-10]。美國(guó)自2012年之后，腸炎沙門菌成為腹瀉型的首位血清型[11]。本研究腸外侵襲性病例的菌型與美國(guó)和我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)一致[12]：腸炎沙門菌替代甲型副傷寒沙門菌成為居第1位的侵襲性血清型，間接證明了城市經(jīng)濟(jì)發(fā)展與衛(wèi)生環(huán)境綜合治理成效的提升，潛在影響食源性疾病總特征趨向發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)的疾病譜。

本研究菌型和耐藥分析結(jié)果證實(shí)了攀枝花市沙門菌臨床分離株的整體耐藥性易受優(yōu)勢(shì)血清型耐藥差異的影響。本研究中，鼠傷寒沙門菌MDR中和1類整合子有關(guān)的ACT/S和ACT/ST耐藥型僅有5株，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、三代頭孢、亞胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷類抗菌藥物高敏感；腸炎沙門菌未見(jiàn)ACT/S和ACT/ST，但對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星的耐藥率較高，與文獻(xiàn)報(bào)道[13]一致，且對(duì)頭孢噻肟的耐藥率超過(guò)20%，符合我國(guó)主流血清型的耐藥特征[14]，對(duì)其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的CTX-M酶基因型值得研究。本地區(qū)腸炎沙門菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率高于鼠傷寒沙門菌，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌的整體耐藥水平低于國(guó)內(nèi)發(fā)達(dá)地區(qū)[10，12，14]，間接證實(shí)了抗菌藥物耐藥性與養(yǎng)殖動(dòng)物生產(chǎn)和醫(yī)源性等對(duì)食源性感染性病原菌產(chǎn)生的不同影響，導(dǎo)致了同屬同血清型菌株出現(xiàn)的耐藥水平差異，而高耐藥克隆株更易在同屬同血清型菌株之間通過(guò)物流和人口流動(dòng)發(fā)生傳播擴(kuò)散[15-16]。

通過(guò)聚集血清型、耐藥性與分子分型，本研究發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)腹瀉的5種優(yōu)勢(shì)菌型均存在不同程度的流行克隆。四川省內(nèi)曾報(bào)道過(guò)鼠傷寒沙門菌的皮蛋克?。罕┌l(fā)的鼠傷寒沙門菌感染多數(shù)與家庭“皮蛋料理”加工冷菜有關(guān)[17]。本地區(qū)鼠傷寒沙門菌感染的臨床散發(fā)病例存在3個(gè)流行克隆，其生態(tài)來(lái)源的多源性特征值得繼續(xù)追溯；腸炎沙門菌單一MDR克隆病例呈高度散發(fā)，其對(duì)萘啶酸和環(huán)丙沙星均高耐藥的情況也值得警惕[13]，腸外侵襲性腸炎沙門菌的MDR將加重疾病負(fù)擔(dān)；病例相對(duì)較少的倫敦沙門菌MDR、斯坦利沙門菌、韋太夫雷登沙門菌均有穩(wěn)定的克隆特征，提示根據(jù)血清型報(bào)告來(lái)發(fā)現(xiàn)和控制潛在食源性暴發(fā)的公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)是積極有效的[18-19]。

致病菌識(shí)別網(wǎng)可在區(qū)域經(jīng)濟(jì)建設(shè)不斷發(fā)展和人口流動(dòng)頻繁的情況下做好主要傳染病監(jiān)測(cè)預(yù)警工作，但仍要應(yīng)對(duì)各種挑戰(zhàn)，應(yīng)持續(xù)加強(qiáng)基于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷、提高醫(yī)防合作的精準(zhǔn)效率，共同應(yīng)對(duì)人民群眾逐漸升高的蛋白質(zhì)消費(fèi)與供應(yīng)鏈帶來(lái)的諸多食源性感染性疾病的防控挑戰(zhàn)與疾病負(fù)擔(dān)[1，20]。