通城虎組織培養(yǎng)技術(shù)

潘麗梅 黃芩芬 陳乾平 萬凌云 付金娥 韋樹根

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西南寧 530023)

馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎（Aristolochia fordiana Hemsl.），別名五虎通城、定心草、萬丈藤、大散血、血蒟等，生于灌叢或石隙，分布于浙江、江西等地，廣西是其主產(chǎn)區(qū)之一［1］。通城虎味苦、辛，性溫，有小毒，有解毒消腫、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、行氣止咳之效，主治風(fēng)濕骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、毒蛇咬傷［2-3］。野生的通城虎資源通常分布于丘陵林下灌木叢中或者周邊石隙中，對生長環(huán)境有一定的要求，因此導(dǎo)致分布范圍并不廣泛。目前國內(nèi)外對通城虎研究極少，尤其對其繁殖方面的研究少之又少，且多限于化學(xué)成分及藥理毒性相關(guān)研究［3-5］。近年來隨著通城虎資源的不斷減少及市場需求量的不斷增加，對野生資源的采集量逐漸增大，導(dǎo)致野生通城虎資源的破壞甚至瀕臨枯竭。通過組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可以有效地利用通城虎的種質(zhì)資源并快速增加其繁殖系數(shù)，不僅能滿足中藥市場對通城虎藥材的需求，更有利于通城虎資源的保護(hù)。因此，本研究以通城虎植株幼嫩莖段為外植體，探討不同消毒時(shí)間及含不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基對通城虎莖段污染、褐化及出芽、生根的影響，以期為通城虎的組織培養(yǎng)快繁提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

試驗(yàn)材料采自廣西藥用植物園科研基地種質(zhì)資源圃，采集通城虎帶有嫩葉的幼嫩莖段，去除多余的老葉后用自來水流水沖洗干凈備用。

1.1.2 試劑

主要試劑包括MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、升汞、75%酒精、2%次氯酸鈉；生長素類似物α-萘乙酸（NAA）、引哚丁酸（IBA）以及2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）；細(xì)胞分裂素6-芐氨基嘌呤（6-BA）、激動(dòng)素（KT）。

1.2 方法

1.2.1 滅菌方式及滅菌時(shí)間的確定

將所采集的枝條剪成1.0～2.0 cm長的帶芽莖段，去掉多余葉片，保留葉柄基部；在加有1%洗潔精的洗滌液中浸泡10～15 min，再用慢流水沖洗15 min；使用4種不同的滅菌方式對外植體進(jìn)行滅菌處理，分別如下：用75%酒精浸泡（處理1）；用0.1%升汞溶液浸泡（處理2）；先用75%酒精浸泡10～30 s再用0.1%升汞溶液浸泡（處理3）；用2%次氯酸鈉溶液浸泡（處理4）。浸泡時(shí)間均分別設(shè)置為4、6、8、10 min，最后用無菌水沖洗4～5次，取出后用滅菌后的紗布吸干表面水分，切去莖段兩頭部位，接種在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中；接種15 d后，統(tǒng)計(jì)污染率和成活率，篩選出合適的消毒劑及消毒時(shí)間。

1.2.2 初代誘導(dǎo)

按完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將經(jīng)過預(yù)處理后的外植體莖段接種到含有不同類型和配比的植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，重復(fù)3次，隨時(shí)觀察記錄莖段的萌芽率、芽生長狀況等。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

選取初代誘導(dǎo)中萌發(fā)后生長狀況一致的組培苗，切取1 cm左右的芽苗接種到含有不同類型及不同濃度激素（6-BA、NAA、IBA）的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)芽苗；隨后觀察記錄芽苗的增殖及生長情況，篩選出最適合通城虎組培苗增殖培養(yǎng)的激素組合。

1.2.4 生根培養(yǎng)

經(jīng)增殖培養(yǎng)后，選取生長健壯、高約2 cm的增殖苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基采用1/2 MS培養(yǎng)基附加不同濃度的IBA（0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L） 和 NAA （0.2、0.5、1.0 mg/L），每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)增殖苗；觀察記錄生根情況及整株生長狀況。

1.2.5 煉苗基質(zhì)篩選

將完成生根的組培苗移出培養(yǎng)室，開蓋煉苗后進(jìn)行移栽，研究不同基質(zhì)處理對組培苗移栽成活率的影響，以期對通城虎種苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論參考。不同基質(zhì)處理如下：（1）輕基質(zhì)；（2）輕基質(zhì)∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1（V∶V∶V，下同）；（3）塘泥；（4）塘泥∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1；（5）育苗土；（6）育苗土∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1。移栽后搭設(shè)遮陽網(wǎng)，觀察記錄移栽苗成活率及生長狀況，篩選適合通城虎組培苗移栽的最佳基質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方式及滅菌時(shí)間的確定

由表1可以看出，不同的滅菌方式及滅菌時(shí)間處理對通城虎外植體的滅菌效果影響差異明顯，僅用75%酒精浸泡的處理污染最嚴(yán)重，成活率也最低，不適合通城虎外植體的滅菌處理，滅菌時(shí)間過短也達(dá)不到滅菌效果；75%酒精和升汞的組合處理效果較好，隨著處理時(shí)間的延長，滅菌效果越長，但時(shí)間過長也會(huì)影響成活率。綜合考慮污染率和成活率，處理3滅菌效果較好，即先用75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min；其次是處理2和處理4。

表1 不同滅菌方式及滅菌時(shí)間對通城虎組織培養(yǎng)污染率和成活率的影響 單位：%

2.2 不同激素處理對通城虎初代誘導(dǎo)的影響

由表2可知，不同激素處理對通城虎莖段的初代誘導(dǎo)有不同的影響。單獨(dú)使用6-BA誘導(dǎo)效果較差；而6-BA與KT組合使用則誘導(dǎo)效果較好，其中，6-BA濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，添加不同濃度的KT和2，4-D誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)6-BA濃度超過1.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)效果反而下降。2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織方面的作用更為明顯，因此綜合芽誘導(dǎo)的啟動(dòng)時(shí)間及誘導(dǎo)率可知，處理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L）誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)100%。

表2 不同激素處理對通城虎初代誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素處理對通城虎增殖培養(yǎng)的影響

不同激素處理對通城虎叢生芽增殖分化的影響不同，激素濃度的高低直接影響其增殖系數(shù)和芽長勢。由表3可以看出，將通城虎接種于不含任何激素的空白培養(yǎng)基中，無增殖效果。在相同6-BA濃度下，添加少量IBA可明顯提高芽的增殖系數(shù)，但NAA的使用對增殖的影響不大。同時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，雖然也有一定的增殖效果，但也極易出現(xiàn)絮狀愈傷組織，影響成苗。因此最佳的激素濃度組合為6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，即處理6，其增殖系數(shù)最高，為（5.53±1.68），且芽生長健壯，葉綠，適合下一步的生根煉苗。

表3 不同激素處理對通城虎增殖培養(yǎng)的影響

2.4 不同激素組合對通城虎生根培養(yǎng)的影響

不同的激素處理都能誘導(dǎo)組培苗生根，但不同的激素濃度生根效果有較大差異。由表4可以看出，MS培養(yǎng)基不適合生根，生根率低且生長弱，比較適合生根的是1/2 MS培養(yǎng)基；隨著激素使用濃度的加大，生根效果越好，但是當(dāng)IBA和NAA濃度都在1.0 mg/L時(shí)，雖然生根效果不錯(cuò)，但根部易出現(xiàn)絮狀愈傷組織，影響移栽成活率。因此，最適合通城虎生根的是處理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L），生根率達(dá)到96.33%。

表4 不同激素組合對通城虎生根培養(yǎng)的影響

2.5 不同基質(zhì)對通城虎組培苗移栽效果的影響

適合的移栽基質(zhì)不僅能提高組培苗移栽成活率，也能提高幼苗生長質(zhì)量。由表5可以看出，處理1的輕基質(zhì)最適合通城虎組培苗的移栽，成活率達(dá)到96%以上，且生長狀態(tài)良好。輕基質(zhì)的成分主要為泥炭土、珍珠巖和蛭石，無需混合其他基質(zhì)即能滿足組培苗的移栽種植；單獨(dú)的育苗土或者塘泥不適合通城虎組培苗的移栽。

表5 不同基質(zhì)對通城虎組培苗移栽效果的影響

3 討論與結(jié)論

組織培養(yǎng)前必須進(jìn)行莖段滅菌處理，不同的物種類型（如木本、草木）以及莖段的幼嫩程度等都對滅菌方式及滅菌時(shí)間有不同的要求。同科屬其他植物的組織培養(yǎng)中，馬兜鈴用12.5 mol/L的乙醇消毒30 s，然后再用0.05%的升汞消毒10～18 min才達(dá)到滅菌效果［6］；而貫葉馬兜鈴的幼嫩莖段則是先用5%酒精浸泡30～40 s，再用0.1%升汞溶液浸泡3 min，方可達(dá)到滅菌效果［7］。本試驗(yàn)中，通城虎幼嫩莖段經(jīng)75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min，滅菌效果較佳。除了滅菌劑的使用濃度不同外，試驗(yàn)中所采集莖段的幼嫩程度也可能不一樣，越幼嫩的莖段，滅菌劑處理時(shí)間應(yīng)越短。

不同的植物生長物質(zhì)是植物組織培養(yǎng)中不可或缺的因子，6-BA和KT都是植物組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素。在本研究中，單獨(dú)使用6-BA的誘導(dǎo)效果較差，與黃果西番蓮［8］、南瓜［9］、白木通［10］等的研究結(jié)果相似，當(dāng)在添加6-BA基礎(chǔ)上添加不同濃度的KT和2，4-D可達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果，但2，4-D不宜過高，否則容易長愈傷組織，從而影響出芽。增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，是培養(yǎng)健壯生根苗的基礎(chǔ)。本研究中，6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L的組合增殖系數(shù)最高，達(dá)到5.53，但NAA對通城虎的增殖培養(yǎng)沒有明顯作用。6-BA作為增殖培養(yǎng)的主導(dǎo)因子，其濃度對增殖培養(yǎng)有明顯的促進(jìn)作用，但濃度過高也容易誘發(fā)愈傷組織，因此適合的6-BA濃度至關(guān)重要，這與白木通［10］、海棠［11］等的研究結(jié)果一致。

組培苗的生根及移栽是植物組織培養(yǎng)體系最后的也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，生長素IBA與NAA組合更有利于生根，但需要適合的濃度。本研究中，當(dāng)IBA和NAA的使用濃度超過1.0 mg/L時(shí)，容易出現(xiàn)愈傷組織，不利于根系形成及后續(xù)移栽。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基不適合生根，可能是營養(yǎng)過剩，促進(jìn)了營養(yǎng)生長，但影響了根系生長，與香鱗毛蕨［12］等的研究結(jié)果一致。在組織培養(yǎng)中，基質(zhì)類型和配比是組培苗成活與否的重要因素。本研究中，輕基質(zhì)即能滿足移栽需求，輕基質(zhì)的成分主要為一定比例的泥炭土、珍珠巖和蛭石，若另外再加入河沙和珍珠巖，移栽效果反而下降，可能是過度透水引起；塘泥、育苗土單獨(dú)使用不適合移栽，原因可能與其不透水性有關(guān)。因此，適合的移栽基質(zhì)需要具備保水而又不過度積水的特性，這樣方可更好地滿足組培苗的移栽需求。本研究從通城虎莖段無菌材料的獲得、芽誘導(dǎo)、繼代增殖及生根、移栽等整個(gè)過程，首次成功建立了通城虎帶芽莖段的組培再生體系，為通城虎的工廠化育苗及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。