丁香油抗炎鎮(zhèn)痛效果的研究

楊冰　李婷婷　楊伊涵　張煒　李小軍　李玉桑　從仁懷　唐和斌

摘要：指出了丁香油是從中藥丁香中提取出來的揮發(fā)油，文獻報道其主要作用是抑菌消炎，但尚未見有報道研究其鎮(zhèn)痛效果及可能機制。研究中用完全弗氏佐劑CFA注射大鼠足底皮膚誘致疼痛作為無菌性的可持續(xù)疼痛模型，檢測了丁香油的消炎特別是鎮(zhèn)痛作用；并在細胞水平上進一步驗證了丁香油主要成分丁香酚對炎癥的抑制作用。研究證明：丁香油通過抑制COX|2上調，可以減輕CFA注射大鼠誘發(fā)的足底腫脹、熱痛覺過敏，表明丁香油具有進一步開發(fā)為改善慢性疼痛藥物的潛質。

關鍵詞：丁香油；抗炎；鎮(zhèn)痛；COX|2

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）20018204

1引言

慢性疼痛顯著地降低了罹患癌癥和糖尿病等慢性疾病病人的生活質量，使得本來就重擔在身的生活雪上加霜。因而，在臨床研究中，如何能發(fā)現(xiàn)更有效的鎮(zhèn)痛藥是一個巨大的挑戰(zhàn)[1，2]。另外，市售鎮(zhèn)痛藥常有很多副作用，如胃腸道反應、嗜睡、瘙癢、成癮性和呼吸抑制等[3]。為此，尋找并發(fā)現(xiàn)新型高效的具有更高安全性的鎮(zhèn)痛藥也是醫(yī)藥界的一大難題。最近許多相關研究發(fā)現(xiàn)，某些中草藥或中草藥提取物能有效的治療或緩解疼痛，如苦參提取物，青風藤提取物[4]，以及傳統(tǒng)上用于止痛的25種植物[5]。

本研究涉及的中藥丁香是桃金娘科番櫻桃屬植物丁香的干燥花蕾，又名公丁香，別名丁子香等。味辛、性溫，歸脾、胃、肺、腎經；為食藥兩用中草藥，也是名貴香料[6]。丁香油是從丁香中分離提取得到的芳香性揮發(fā)油，是主要的抑菌成份。丁香油主要成分已經鑒定出，分別是丁香酚、β-石竹烯和乙?；∠惴覽7]。丁香油主要用于化妝品，食品芳香劑、防腐劑，臨床主要用于牙痛、風濕性疼痛及一些菌性炎癥[8]。

目前，尚未見評估丁香油改善炎性疼痛作用的研究。本研究利用大鼠的足底炎性疼痛模型，引入兩種不同的評價方法來測試丁香油抗炎和鎮(zhèn)痛作用。此外，還在細胞水平上檢測了與炎癥誘導密切相關的分子環(huán)氧化酶COX|2的表達水平[9]。

2實驗材料和方法

2.1實驗儀器

熱痛儀（意大利Ugo Basile）；足趾腫脹儀（成都泰盟）；水置換體積計（PV-200；成都泰夢軟件有限公司，中國成都）；電泳儀（美國，BIO-RAD）；等。

2.2實驗試劑

完全弗氏佐劑（CFA，美國Sigma公司）；生理鹽水（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)）；雙氯芬酸鈉（北京諾華）；丁香油和氣相色譜-質譜（GCMS）丁香油的結果由無限極（中國）有限公司，廣州。所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich，USA。

2.3實驗動物

在實驗開始之前，將96只年輕雄性Wistar大鼠（190～250 g）在無病原體實驗室飼養(yǎng)7 d，保證實驗室12 h光-夜循環(huán)，溫度為22～25℃。許可證號：SCXK（鄂）2008-0005，合格證編號：No.42000600004036。

2.4實驗方法

2.4.1丁香油的分離提取

2.4.1.1蒸餾丁香油

將干燥丁香花蕾（購自中國廣西藥品廣西中藥廣州藥業(yè)中藥廠）粉碎并與水以1 g∶10 mL混均。然后，在蒸汽蒸餾裝置中蒸餾混合物8 h得丁香油。

2.4.1.2 GCMS分析丁香油

將丁香油（0.103 g）置于裝有正己烷（色譜純）的10 mL容量瓶中定容并混均。取上述溶液0.5 μL進樣到GC。檢測器為質譜選擇性Agilent 5975 檢測器，并耦合GCMS分析裝置Agilent 7890（II）GC。用HP-5MS毛細管柱分離揮發(fā)性化合物。溫度由40℃ （1 min） 以5℃/min升到220℃，并保持1 min；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。分析丁香揮發(fā)油時，使用分流模式，比例為1∶60，噴射器溫度為240℃，所有樣品一式三份進行分析。用正烷烴計算保留指數(shù)（RI），通過比較其RI相對于從HP-5MS柱獲得C4-C30正烷烴的值來鑒定組分；并將所得結果與NIST質譜提供的數(shù)據(jù)庫進行比較，當質譜和RI值良好匹配時，確定正確識別組分。

2.4.2炎癥性疼痛模型

將大鼠隨機分為對照組（替代CFA的生理鹽水注射）和CFA誘發(fā)的炎性疼痛組（CFA注射），不同組詳細內容見“結果”部分。將150 μL CFA皮下注射到大鼠左后足底部，誘導炎癥性疼痛；對照大鼠注射等體積生理鹽水。注射CFA后，將對照組大鼠隨機分為3組（對照組），分別在第1周，第2周或第3周結束時處死。同時將CFA組隨機分為CFA處理組（CFA），CFA處理連續(xù)灌胃雙氯芬酸鈉組（CFA+diclo，30 mg/kg/d，諾華，北京），以及CFA處理連續(xù)灌胃丁香油組（CFA+ Clove Oil，10 mg/kg）。這些大鼠也分別第1周，第2周或第3周結束時處死。

2.4.3炎癥評估

通過測量足底腫脹大小來評估炎癥程度。用水置換體積計（PV-200；成都泰夢軟件有限公司）測量每只大鼠左足與其右足的體積，每只足被測3次，取其平均值。

2.4.4疼痛評分測試

全部行為評估均按照國際疼痛研究協(xié)會（IASP）的道德準則進行。所有行為測試都在雙盲條件下進行。并且，所有行為測試均在以下時間點進行：CFA注射后1，2或3周；評估疼痛評分也是在雙盲情況下4人分別單獨完成。具體方法及過程請參看本實驗室前期文章。

2.4.5熱痛覺過敏試驗

為了確定給藥處理后大鼠對熱刺激的傷害感受反應情況，使用足退縮反應潛伏期（WRL）值來測量。即是，將動物放在具有玻璃地板的塑料室中，使其適應10 min；輻射熱源置于大鼠每只后足所在的玻璃地板下方。使用足底測試儀（Ugo Basile Srl，Varese，Italy）測量足WRL值精確到0.1 s。校準光源強度，以在自然狀態(tài)下動物在16～25 s范圍內產生足退縮反應為度。大鼠兩只后足每只測3次，取其平均值。計算每只后足的WRL值。測量時間設定為60 s。endprint

2.4.6細胞實驗

選取NIH3T3細胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基加入10% CS作為完全培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2條件下進行培養(yǎng)。Western blot法測定細胞COX|2蛋白的表達水平：接種培養(yǎng)生長對數(shù)期NIH3T3細胞系于35 mm皿中，經不同濃度丁香酚干預2 h后，換液再加入400 ng/mL LPS和不同濃度丁香酚共處理24 h。提取細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF濾膜，5%脫脂奶粉封閉，加入針對COX|2抗原的抗體；洗滌后加入相對應HRP標記的二抗，加入化學發(fā)光底物進行顯色，分析目標蛋白條帶光密度。

2.4.7統(tǒng)計分析

本文中所有行為測試結果（除非另有說明）以平均值±SEM的形式表示為CFA注射足以及對照足的值。在Origin8.0（Originlab Corp.，MA，USA）進行單因素方差分析，然后進行Bonferroni posttests統(tǒng)計分析。所有測試均為雙尾，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，在所有圖中*，**或***分別表示P<0.05、0.01或0.001。

3結果

3.1鑒定丁香油的組成

本研究中使用的丁香油主要化合物是丁香酚（78.69%）、β-石竹烯（11.74%）、α-石竹烯（1.59%）、石竹烯氧化物（1.11%）等。描述主要化合物的數(shù)據(jù)如表1所示，將分離鑒定出的成分與文獻[7]對比發(fā)現(xiàn)，除文獻中乙?；∠惴樱?.60%）含量較多外，丁香酚（70.61%）、β-石竹烯（18.91%）、α-石竹烯（2.12%）差別不大；考慮到丁香的來源、分離提取的方法以及所使用的儀器，這些差別是可接受的，也表明我們的鑒定結果是可靠的。

3.2丁香油減輕CFA注射誘發(fā)的大鼠后足炎性腫脹

為了評價丁香油的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，將應用材料和方法部分描述的CFA注射大鼠模型進行研究。如圖1（a）所示，在CFA注射前，在每組大鼠的右后足未觀察到腫脹。在CFA注射后，與對照組相比，大鼠注射的后足顯示出一定水平的腫脹（圖1（b），模型組233.68 ± 6.83%，對照組為103.47 ± 1.11%， n=19），且腫脹程度呈時間依賴性降低。給予不同的治療（陽性藥組給藥雙氯芬酸鈉，30 mg/kg/d，n=19；丁香油組給藥丁香油，10 mg/kg/d 等同60 kg人給藥100mg /d，n=19），與模型組相比，腫脹程度降低得更快。更重要的是，在丁香油存在下，大鼠后足腫脹程度降低比陽性藥組明顯增加，只在第21 d時腫脹程度降低不如陽性藥組明顯（第7d，丁香油組159.29±4.67%，陽性藥組164.64±3.70%；第14d，丁香油組133.10±3.74%，而陽性藥組為141.09±5.61%；第21 d，陽性藥組128.41±1.86%，而丁香油組為135.37±5.46%）。且在實驗過程中，每組大鼠的左后足均未觀察到腫脹（圖1c）。對比陽性藥組和丁香油組的結果，我們發(fā)現(xiàn)丁香油的抗炎效果優(yōu)于雙氯芬酸鈉的抗炎效果。

3.3應用丁香油部分恢復CFA注射大鼠誘發(fā)的疼痛

為了更好地表征不同給藥處理下大鼠炎癥相關的疼痛狀態(tài)，本研究中引入了疼痛評分試驗。疼痛評分試驗的詳細過程在前文已有描述。如圖2（a）所示，模型組CFA注射后，其疼痛評分從第0d 0.27±0.06被提高到第1 d 1.70±0.07，且在實驗過程中持續(xù)21 d保持在相對較高的水平（第21 d為1.06±0.18），表明CFA注射成功誘發(fā)大鼠后足顯著并可持續(xù)的疼痛。陽性藥雙氯芬酸鈉給藥處理后，疼痛評分在第1 d下降至1.17±0.07，并進一步下降。在第21 d降至0.72±0.17。丁香油給藥后，在第1 d將疼痛評分降低至1.39±0.12，然而，其后下降加快，在第21d將疼痛評分降低至0.58±0.13，與對照組（0.53±0.23）相當，但超過雙氯芬酸鈉給藥的效果。表明丁香油能更好地減輕由CFA注射引起的炎性疼痛反應。

注：對照組；模型組；陽性藥（雙氯芬酸鈉）組；丁香油組。 *，**，***分別代表P<0.05，0.01，0.001。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示

接著考慮利用傳統(tǒng)的熱痛痛閾檢測來進一步評估丁香油改善炎性疼痛的作用。如圖2（b）所示，觀察到CFA注射后熱誘導的疼痛反應快速而顯著的增敏，并隨試驗時間的延長逐步回升。陽性藥組給予雙氯芬酸鈉治療后，大鼠的熱痛閾值從第1d的33.22±2.67%到第14d的79.33±7.46%、第21d的100.86±13.16%，遞增約3倍。而給予丁香油治療后，大鼠的熱痛閾值從第1d的34.87±2.45%到第14d的78.66±4.32%、第21d的83.69±11.11%，遞增約2倍多。與陽性藥組雙氯芬酸鈉的效果類似，丁香油對炎性疼痛也顯示較好的效力。

注：數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。

3.4丁香油應用在細胞水平上抑制COX|2表達

眾所周知，丁香油具有抗致病性真菌、葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等多種微生物的功效；并早已應用于牙痛、皮膚病、菌類引起的炎癥等。在本文前面已經證實，丁香油中主要成份為丁香酚，這與文獻報道的結果是相符的。前人研究表明：丁香酚是丁香油中起作用的主要成份。目前，已經證明CFA注射可誘導大鼠COX|2表達[10～12]。LPS為較為常用的炎癥誘導劑。為了檢測丁香油的應用是否是通過抑制COX|2來減輕疼痛，我們擬用丁香酚和LPS刺激NIH3T3細胞，收集蛋白并用蛋白雜交檢測COX|2的表達。如圖3所示，COX|2的表達量在丁香酚和LPS處理后有所變化。單獨LPS處理后NIH3T3細胞內COX|2表達顯著上調；丁香酚和LPS共同刺激后，隨丁香酚的濃度增加COX|2表達顯著下調。提示丁香酚可抑制NIH3T3細胞的COX|2表達，且抑制能力與其濃度正相關；進一步提示丁香油是通過抑制CFA注射大鼠誘導的COX|2表達上調來減輕疼痛。endprint

4結論及討論

4.1結論

本文已經證明丁香油可以通過抑制COX|2的表達上調來潛在地緩解CFA注射大鼠誘發(fā)的關節(jié)腫脹和熱痛覺過敏，因此丁香油有望成為一種緩解慢性炎癥和疼痛的潛在藥。

注：不同濃度丁香酚和LPS處理鼠源NIH3T3細胞后蛋白雜交得到的COX|2表達及定量圖。數(shù)據(jù)均以平均值 ± SEM表示

圖3丁香油通過抑制COX|2表達來緩解疼痛

4.2討論

丁香油主要成分為丁香酚，其也是藥物活性的主要成分。丁香酚有多種藥理藥效作用，但也存在一些毒副作用：例如有一定的腐蝕性；有刺激性，其會引起呼吸綜合癥；誤食后其會導致代謝性酸中毒[13]。有報道稱，丁香酚用于牙痛時會引起慢性蕁麻疹、接觸性蕁麻疹、變應性接觸性皮炎等過敏反應[14]。在該研究中，丁香油用量較小；并且在實驗中，大鼠用丁香油處理后，沒有觀察到其任何異常行為。因此，本研究中使用的丁香油至少對于實驗動物是安全的。為了人類的進一步使用，應進行更多的毒性和安全性實驗。

在本研究中，大鼠經CFA注射后成功地在熱和觸覺刺激下產生了應激反應（疼痛評分試驗檢測到大鼠在行走期間的恢復行為，其可被視為觸覺應激反應），表明CFA注射可致如前所述的疼痛[15]。然而，與以前的研究不同，本研究中CFA注射大鼠后3周，依然檢測到相對持久的異常性疼痛和熱痛覺過敏。數(shù)據(jù)顯示，在第3周特別是模型組的測試大多數(shù)沒有恢復到對照組水平，表明CFA注射對大鼠的影響至少可持續(xù)3周。

雙氯芬酸鈉屬于非甾體類抗炎藥，其是最常用的鎮(zhèn)痛藥之一[16]。其作為抗炎鎮(zhèn)痛藥，它可能是前列腺素最有效的抑制劑；常用于治療風濕性疾病[17]和術后止痛[18]等。然而，諸如頭痛、頭暈、皮疹、水腫以及對腎肝的潛在損傷等副作用限制了其臨床應用。為此，人們進行了許多研究，嘗試用其他物替代雙氯芬酸鈉，如維生素B和維生素E[19]。除副作用外，雙氯芬酸鈉（30 mg/kg/d）在抗炎方面不如該研究中觀察到的丁香油那樣有效。相比之下，丁香油在抗炎方面表現(xiàn)更好。

多年來，人們一直認為COX|2在炎癥引起的疼痛中發(fā)揮重要作用，研究已經表明，大鼠經CFA注射后6 h，其COX|2蛋白和mRNA表達水平急劇升高[20]。然而，在本研究中已經在細胞水平證明COX|2的上調可被丁香酚抑制，這表明丁香油具有緩解炎癥和慢性疼痛的作用。

參考文獻：

[1]

Mogil J S， Davis K D， Derbyshire S W. The necessity of animal models in pain research[J]. Pain， 2010， 151（1）：12～17.

[2]Johannes C B， Le T K， Zhou X， et al. The prevalence of chronic pain in United States adults： results of an Internet-based survey.[J]. Journal of Pain， 2010， 11（11）：1230.

[3]旋靜. 鎮(zhèn)痛藥的不良反應及處理的臨床發(fā)展概況[J]. 中國醫(yī)藥指南， 2015（16）：50～51.

[4]周志梅， 郭世民， 何靜，等. 鎮(zhèn)痛中藥的研究進展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志， 2007， 28（4）：52～54.

[5]Adebayo S A， Dzoyem J P， Shai L J， et al. The anti-inflammatory and antioxidant activity of 25 plant species used traditionally to treat pain in southern African[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine， 2015， 15（1）：1～10.

[6]朱金段， 袁德俊， 林新穎. 丁香的藥理研究現(xiàn)狀及臨床應用※[J]. 中國藥物經濟學， 2013（1）：32～35.

[7]但春， 丁立生， 彭樹林， 等. 丁香和升麻的化學成分研究[D]. 北京：中國科學院， 2006.

[8]李英嘉， 劉洪章. 丁香揮發(fā)油的研究進展[J]. 黑龍江農業(yè)科學， 2014（7）：148～151.

[9]朱小燕， 郭曲練， 等. P300 介導調控神經病理性疼痛因子COX|2的表觀遺傳學研究[D]. 長沙：中南大學， 2013.

[10]Seybold V S， Jia Y P， Abrahams L G. Cyclo-oxygenase-2 contributes to central sensitization in rats with peripheral inflammation[J]. Pain， 2003， 105（1-2）：47～55.

[11]Maciel I S， Silva R B， Morrone F B， et al. Synergistic effects of celecoxib and bupropion in a model of chronic inflammation-related depression in mice.[J]. Plos One， 2013， 8（9）：e77227.

[12]Fang J Q， Fang J F， Liang Y， et al. Electroacupuncture mediates extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways in the spinal cord of rats with inflammatory pain[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2014， 14（1）：1～12.endprint

[13]孔曉軍， 李劍勇， 等. 阿司匹林丁香酚酯的致畸致突變研究[D]. 北京：中國農業(yè)科學院， 2013.05.

[14]Tammannavar P， Pushpalatha C， Jain S， et al. An unexpected positive hypersensitive reaction to eugenol[J]. Bmj Case Reports， 2013.

[15]王倩， 張娟， 周一，等. CFA注射致炎性疼痛過程中海馬內BDNF的表達及作用研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2014， 14（36）：7001～7006.

[16]陸小松， 吳天興， 曹杰，等. 雙氯芬酸鈉的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2016（5）：81～84.

[17]盛桂華， 朱海亮， 等. 非甾體抗炎藥雙氛芬酸配合物的合成、結構表征及其生物活性研究[D]. 南京：南京大學， 2015.

[18]Mohammadi S S， Abdi M， Movafegh A. Comparing Transcervical Intrauterine Lidocaine Instillation with Rectal Diclofenac for Pain Relief During Outpatient Hysteroscopy： A Randomized Controlled Trial[J]. Oman Medical Journal， 2015， 30（3）：157.

[19]Sena M M， Chaudhry Z F， Collins C H， et al. Direct determination of diclofenac in pharmaceutical formulations containing B vitamins by using UV spectrophotometry and partial least squares regression[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis， 2004， 36（4）：743～749.

[20]Fang J Q， Fang J F， Liang Y， et al. Electroacupuncture mediates extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways in the spinal cord of rats with inflammatory pain[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2014， 14（1）：1～12.

Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Clove Oil

Yang Bing1， Li Tingting1， Yang Yihan1， Zhang Wei1， Li Xiaojun1， Li Yusang1， Cong Ronghuai2， Tang Hebin1

（1.School of Pharmaceutical Sciences，South-central University for Nationalities，Wuhan，Hubei，430074，China；

2.Infinitus （China） Company Ltd.， Guangzhou， Guangdong， 510665， China）

Abstract： Chronic pain， or sometimes referred to as sustainable pain， could cause physical and mental suffering and hence reduce the life quality of patients with chronic diseases such as cancer and diabetes. In recent years， Chinese Medicine， the treasure of Chinese traditional physic， has drawn more and more attentions for the search of effective drugs that can suppress chronic pain. The drug effect of Clove oil， a kind of volatile oil extracted from a Chinese traditional medicine， Ding Xiang， or Syzygiumaromaticum L.， is mainly restricted in anti-bacterial activity according to current literatures. However， hardly any research has focused on the effect and detailed mechanism of its anti-inflammatory and analgesic effects. Therefore， in the current study， we used CFA-injected rats as a model of sterile chronic-pain and detected the anti-inflammatory and especially analgesic effects of clove oil. In addition， we proved in the cellular level that eugenol， the main ingredient of clove oil， could alleviate inflammation. All together， we have proven that clove oil could reduce the paw swelling and the pain hyper-sensation of rats injected with CFA by inhibiting the up-regulation of COX|2， all of which demonstrated a potential of clove oil to be further developed into a chronic pain killer.

Key words： clove oil； anti-inflammatory； analgesic effects； COX|2endprint