食品中嘔吐毒素Cereulide特性及 檢測(cè)方法研究進(jìn)展

羅信旭，謝 珊

（貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550004）

1 Cereulide特性

Cereulide是由蠟樣芽孢桿菌ces基因簇編碼的產(chǎn)物，該基因簇位于蠟樣芽孢桿菌質(zhì)粒DNA上，主要包括7個(gè)編碼區(qū)，其中cesA基因和cesB基因與Cereulide合成有關(guān)。Cereulide具有致吐作用，故稱其為嘔吐毒素。值得注意的是該嘔吐毒素與人們常說的嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）是兩種不同的物質(zhì)，后者由鐮刀菌產(chǎn)生。除蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生Cereulide外，耐冷型魏登施泰藤芽孢桿菌（Bacillus weihenstepha nensis）也能產(chǎn)生Cereulide。Cereulide是由[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3組成的一種十二環(huán)狀多肽，分子量1.2 kDa，不溶于水，脂溶性大，耐蛋白酶水解，對(duì)酸、堿不敏感，在121 ℃高溫下維持30 min仍具有活性，一般的食品加工過程不能將其破壞，屬于耐熱型腸毒素，在活菌被消除的情況下仍存在食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)。Cereulide是一種特異性K+載體，能將K+轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)，從而改變細(xì)胞內(nèi)外K+濃度差，進(jìn)而破壞線粒體的氧化還原能力，影響細(xì)胞的正常代謝。Cereulide的同分異構(gòu)體有7種，分別為Isocereulide A～G[1]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子量與纈氨霉素十分相似，但Cereulide與K+的親和力更大，毒性更強(qiáng)。Cereulide會(huì)使腸道細(xì)胞上皮電阻變大，緊密連接蛋白claudin-4的表達(dá)量增加，從而改變腸道細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化，使腸道喪失屏障功能[2]。

2 Cereulide影響因素

2.1 菌株類型

Cereulide的產(chǎn)量是由內(nèi)在因素（菌株類型）和外在因素（環(huán)境因素）共同決定的。并非所有蠟樣芽孢桿菌都能產(chǎn)生Cereulide，如ATCC 14579，該菌株不產(chǎn)生嘔吐毒素，過去研究得出只有5%～6%的蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生[3]。最近大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌攜帶Cereulide基因的范圍已遠(yuǎn)高于5%～6%[4-5]。

2.2 環(huán)境因素

環(huán)境因素對(duì)Cereulide合成的影響很大，主要包括溫度、環(huán)境pH、氧氣、離子濃度和基質(zhì)類型的影響。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生Cereulide的蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度主要集中在12～45 ℃，低于12 ℃部分基質(zhì)中仍能產(chǎn)生Cereulide，超過45 ℃不再產(chǎn)生。AGATA研究發(fā)現(xiàn)[6]，酸性條件下蠟樣芽孢桿菌更容易產(chǎn)生Cereulide。楊佐毅等人[7]發(fā)現(xiàn)Cereulide的產(chǎn)生必須有氧氣的參與，厭氧條件下不產(chǎn)毒。SHAHEEND等人[8]在研究嬰幼兒配方奶粉中Cereulide產(chǎn)生情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氧氣濃度低于1.6%后，蠟樣芽孢桿菌不再產(chǎn)生Cereulide。APETROAIE-CONSTANTIN等人[9]在研究離子濃度對(duì)Cereulide合成的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)低鹽離子濃度更有利于Cereulide的產(chǎn)生。MESSELHAUSSER等人[10]發(fā)現(xiàn)富含維生素和微量元素的食物能促進(jìn)Cereulide的產(chǎn)生。此外，培養(yǎng)基的狀態(tài)也會(huì)影響Cereulide的產(chǎn)量[11]，固體培養(yǎng)基較液體培養(yǎng)基更容易產(chǎn)生。有學(xué)者就不同食物基質(zhì)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的生長和Cereulide的產(chǎn)量影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌在谷物基質(zhì)中產(chǎn)生的Cereulide明顯高于培養(yǎng)基，在肉和蔬菜基質(zhì)中產(chǎn)量最少[12]。以上學(xué)者對(duì)Cereulide合成影響的研究，對(duì)食品儲(chǔ)存具有實(shí)際的指導(dǎo)意義，應(yīng)盡量選擇低溫、真空條件保存食品。

3 Cereulide檢測(cè)方法

關(guān)于嘔吐毒素Cereulide的檢測(cè)，主要有以下4種方法。

（1）動(dòng)物試驗(yàn)法。該方法只能對(duì)Cereulide定性，得出的結(jié)果不準(zhǔn)確，而且費(fèi)用較高。

（2）生物檢測(cè)法。屬于半定量檢測(cè)，目前有兩種，分別是細(xì)胞空泡應(yīng)答檢驗(yàn)法和體外精子活力試驗(yàn)法。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高，一般實(shí)驗(yàn)室很難進(jìn)行，不能大面積推廣。

（3）PCR檢測(cè)法。該方法能從基因?qū)用嫔蠈?duì)產(chǎn)Cereulide的菌株進(jìn)行快速檢測(cè)，缺點(diǎn)在于該方法不能達(dá)到毒素定量檢測(cè)目的。

（4）化學(xué)檢測(cè)法。有高效液相色譜（HPLC）、飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-ESI-TOF）[13]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）[14]、反向色譜（RPC）[15]等，其中HPLC-MS聯(lián)用法被認(rèn)為是Cereulide檢測(cè)和定量的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也使用得最多。該方法靈敏、準(zhǔn)確，定量限為10 ng/kg，檢出限為3 ng/kg。HPLC-MS聯(lián)用法測(cè)定食品中Cereulide有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種。除Cereulide外，人工合成的13C6-Cereulide和纈氨霉素均可作為內(nèi)標(biāo)物。研究發(fā)現(xiàn)選用13C6-Cereulide作為內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果明顯優(yōu)于纈氨霉素。HPLC-MS聯(lián)用法雖是Cereulide定量的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法所用設(shè)備均屬于大型精密高端設(shè)備，眾多實(shí)驗(yàn)室不具備該條件，因此，普及十分困難。為了克服以上難題，Kalbhenn等[15]研究者初次嘗試運(yùn)用RPC對(duì)Cereulide進(jìn)行分離和定量，并運(yùn)用HPLC-MS聯(lián)用法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RPC能精確地對(duì)樣品中的Cereulide進(jìn)行分離定量。相對(duì)HPLC-MS聯(lián)用法，RPC是一種更加經(jīng)濟(jì)、更加簡便且常規(guī)實(shí)驗(yàn)室均可開展的檢測(cè)手段。

4 結(jié)語

我國食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.14—2014和進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0176—2003。該方法操作程序復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長，對(duì)致病菌的檢測(cè)特異性不高且檢出限較高，主要用于活菌數(shù)的定量，不適用于由Cereulide引起的食物中毒，無法有效保證食品安全。近年來，Cereulide引起的食物中毒時(shí)有發(fā)生，因此建立食品中Cereulide的快速檢測(cè)方法和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)十分有必要。