miRNA在卵巢早衰顆粒細(xì)胞中的研究進(jìn)展

梁競文 歷 凱 孫麗英 張宇馳 葛鵬玲

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是40歲以前出現(xiàn)的閉經(jīng)現(xiàn)象，表現(xiàn)為促性腺激素水平下降、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、不育和圍絕經(jīng)期綜合征，這種情況可能會對生殖、心理健康和生理健康產(chǎn)生不利影響，其與遺傳因素、病毒感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病、醫(yī)源性損傷等有關(guān)[1，2]?；颊叱霈F(xiàn)圍絕經(jīng)期潮熱盜汗、性欲減退、陰道干澀、失眠、月經(jīng)減少、稀發(fā)，甚則不孕的一系列癥狀，同時(shí)伴隨體內(nèi)雌激素(estrogen，E2)降低，卵泡刺激素(follicule stimulating hormone，F(xiàn)SH)升高，黃體生成素(luteotropic hormone，LH)升高或不變[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為POF的相關(guān)病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此探尋該病發(fā)病機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。在治療方面，激素代替療法(hormone replacement treatment，HRT)是使用較為廣泛的方法，另外還有誘導(dǎo)排卵、卵巢移植或一些聯(lián)合治療等，研究表明HRT能預(yù)防骨質(zhì)流失并促進(jìn)心血管健康，但也有資料表明激素治療中可能存在著一些不良反應(yīng)，而且可能有增加卵巢癌或其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)，這一點(diǎn)仍待考證[4，5]。

在卵巢中卵泡的發(fā)育過程是復(fù)雜的，它是由原始卵泡經(jīng)過初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡從而進(jìn)一步發(fā)育成熟直至排卵或閉鎖的[6]。由于顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GCs)的凋亡導(dǎo)致了卵泡閉鎖，因此GCs功能障礙也許會是POF可能的病理特征之一[7]。GCs的作用也引發(fā)了研究卵巢相關(guān)疾病的重要性，加之miRNA在組織發(fā)育和分化過程中起關(guān)鍵作用，近年來在探討POF發(fā)病機(jī)制方面開始有學(xué)者聚焦于GCs中miRNA的研究，尋找可以調(diào)節(jié)POF中GCs功能障礙的miRNA也會為改善POF患者提供新的范例。故本文將對miRNA在POF顆粒細(xì)胞中的相關(guān)研究進(jìn)展展開綜述。

一、miRNA在卵巢中的作用

微小RNA(microRNA、miRNA)是一類小型非編碼RNA，改變其表達(dá)水平關(guān)聯(lián)多種病理狀況。它們通過與靶基因3′UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合而引起mRNA變性或基因沉默，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制。 miRNA還可能控制了生殖內(nèi)分泌功能，并在卵母細(xì)胞成熟和卵泡形成過程中發(fā)揮著重要的作用。在類固醇合成中，miRNA還與性腺體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)有關(guān)。據(jù)估計(jì)，miRNA可調(diào)節(jié)70%以上蛋白質(zhì)編碼基因的翻譯，并參與增殖、分化、凋亡、發(fā)育等。在POF潛在的機(jī)制中，對蛋白質(zhì)編碼遺傳因子的研究最為深入，然而，蛋白質(zhì)編碼基因的編碼外顯子在基因組中的占比非常少，所以基因組的非編碼部分在之前的研究中已被認(rèn)為是表觀遺傳調(diào)控因子，對人體的發(fā)育、生理和疾病有至關(guān)重要的作用。研究最多的非編碼區(qū)類別的典型示例即是miRNA，并且miRNA在卵巢中的研究與探索逐漸增多，高通量與生物信息學(xué)等方法已找尋了大量相關(guān)的miRNAs，這也揭示了對卵巢基本功能存在的影響。研究揭示了幾種miRNAs在不同物種卵巢中的表達(dá)，表明它們可能在卵巢功能中發(fā)揮重要作用。miR-23a、miR-27a、miR-22-3p、miR-146a、miR-196a、miR-290-295、miR-423和miR-608等都可能與POF有關(guān)。對哺乳動物卵巢中這些miRNA的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測、篩選和基因本體論分析也可以確定生物學(xué)過程和途徑或分子網(wǎng)絡(luò)，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長增殖等。

miRNA在卵巢中作用的研究主要是通過Dicer進(jìn)行的，Dicer是核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族成員，其能在RNA干擾(RNAi)途徑中發(fā)揮作用，將長的雙鏈RNA切割成小RNA，這其中就包括miRNA。當(dāng)非編碼序列由RNA聚合酶Ⅱ和RNase Ⅲ家族成員Drosha和Dicer處理時(shí)，會生成成熟的miRNA。Dicer對于卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育以及對激素信號的響應(yīng)是必不可少的[8]。Otsuka等[9]研究證明了由于亞型突變導(dǎo)致的Dicer表達(dá)減少以及由于卵巢血管生成缺陷和黃體功能不全而導(dǎo)致的不孕等現(xiàn)象。但Dicer作為miRNA生物發(fā)生所必需的進(jìn)化保守的關(guān)鍵因素，在女性生殖系統(tǒng)中對GCs等的具體功能尚不清楚。因此，研究Dicer在GCs中的功能也許可以深入了解miRNA在GCs中的作用。

二、顆粒細(xì)胞(GCs)與卵巢早衰(POF)

由于POF的機(jī)制尚未查清，因此諸多學(xué)者致力于研究其機(jī)制及可能的延緩方法，其中值得注意的是原始卵泡的耗竭與成熟卵泡的質(zhì)量,二者提示了POF可能的機(jī)制。在卵泡的發(fā)育過程中由于卵母細(xì)胞的增大，使得周圍的顆粒細(xì)胞由原始卵泡中卵母細(xì)胞周圍的一層立方狀的顆粒細(xì)胞分裂成為多層立體狀細(xì)胞層。由于從原始卵泡到成熟卵泡的轉(zhuǎn)變涉及了GCs的分化和功能轉(zhuǎn)化，因此，GCs與卵母細(xì)胞之間的相互作用對于協(xié)調(diào)卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要。卵母細(xì)胞通過一些激活因子的分泌協(xié)調(diào)GCs的增殖和分化，GCs也為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)因子。另外，卵泡的閉鎖主要是由GCs凋亡引起的，GCs還可以通過分泌AMH、FOXL2等調(diào)控原始卵泡的激活。因此，抑制顆粒細(xì)胞凋亡對于改善POF起著重要作用，在細(xì)胞凋亡中，Bcl-2家族與caspase家族的重要性是顯著的，另外FAS通路與TNF通路等都可以介導(dǎo)凋亡，通過檢測相關(guān)蛋白的作用對于疾病的研究也有重要的導(dǎo)向作用。

GCs中miRNA的表達(dá)可能對卵泡生成和卵巢類固醇生成中涉及的特定基因的表達(dá)具有直接的調(diào)節(jié)作用。研究表明，miRNA參與控制了卵巢類固醇P和E2的釋放[10]。miRNA的表達(dá)差異可能解釋了異常的卵泡發(fā)育，這也有助于鑒定與該表型有關(guān)的途徑。

三、miRNAs在卵巢早衰(POF)中對顆粒細(xì)胞(GCs)調(diào)控作用的研究

1. miRNAs通過參與GCs激素途徑調(diào)控POF:在卵巢中，激素水平的變化可以幫助判定病變情況，包括雌二醇(E2)、黃體激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等。有研究表明，卵巢中促卵泡激素受體(FSHR)僅在GCs中表達(dá)，這對于它們的增殖、生長、功能和分化至關(guān)重要。經(jīng)過FSH處理可以誘導(dǎo)GCs中100多個(gè)基因的表達(dá)[11，12]。FSH誘導(dǎo)的TGF-β途徑調(diào)控已在不同哺乳動物物種的GCs中得到證實(shí)，例如人和大鼠等。另一方面，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與叉頭盒L2蛋白(FOXL2)共同調(diào)節(jié)FSHR，因而影響了卵泡中GCs正常增殖和分化等功能。在卵泡形成過程中，F(xiàn)OXL2與TGF-β超家族成員通過自分泌調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮了涉及細(xì)胞內(nèi)FSHR轉(zhuǎn)錄和GCs增殖的雙向調(diào)節(jié)作用，激活素A和生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)等[13]。另外，在卵泡發(fā)育過程中，F(xiàn)SH還增強(qiáng)了GCs細(xì)胞中孕酮的產(chǎn)生。Yao等[14]證明了在FSH誘導(dǎo)的大鼠卵巢GCs孕激素分泌過程中，miR-29a和miR-30d顯著下調(diào)，這表明它們可能對孕酮的合成有影響。FSH介導(dǎo)的作用除其他信號級聯(lián)反應(yīng)外，還通過3′，5′-單磷酸(cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白途徑完成。由此可見，miRNA可通過與GCs中的FSH途徑相互作用來調(diào)節(jié)GCs增殖、激素分泌以及分化等。GCs中miRNA的表達(dá)也可能對卵泡生成和卵巢類固醇生成中涉及的特定基因的表達(dá)具有直接的調(diào)節(jié)作用。

FOXL2序列和哺乳動物表達(dá)的高度保守性提示了在卵巢發(fā)育和功能中可能的關(guān)鍵作用，F(xiàn)OXL2還參與了炎癥、細(xì)胞凋亡、活性氧代謝等。叉頭L2蛋白(FOXL2)在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因來參與類固醇的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-133b可以通過靶向STAR和CYP19A1下調(diào)FOXL2在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)并且促進(jìn)了顆粒細(xì)胞中雌激素的合成，這為改善POF患者E2激素的下降提供了可能性。

除去促性腺激素、類固醇和其他多種生長因子之間的復(fù)雜相互作用外，卵泡的發(fā)育還應(yīng)該受到來自不同細(xì)胞的不同信號的調(diào)控，GCs中分泌的激素也受到另外一些miRNA的影響，研究表明，miR-144通過抑制環(huán)氧合酶2的表達(dá)來抑制前列腺素E2，前列腺素E2是重要的卵泡內(nèi)旁分泌調(diào)節(jié)劑，在排卵過程中具有特殊作用、miR-375介導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號通路并抑制卵泡雌二醇合成、miR-96靶向Forkhead box蛋白O1(FOXO1)以誘導(dǎo)人GCs中類固醇的產(chǎn)生[15～17]。miR-378通過靶向豬GCs中的芳香化酶來調(diào)節(jié)卵巢雌二醇的產(chǎn)生。miR-320通過在卵泡發(fā)育過程中靶向E2F1和SF-1來調(diào)節(jié)類固醇的產(chǎn)生等。這些都在激素途徑上起到相關(guān)的作用，后續(xù)研究也可以引起對這些miRNA的重視。

2.miRNAs通過顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控POF：在構(gòu)建POF模型時(shí)，常用化學(xué)藥物或放射性處理來建立，如4-乙烯基環(huán)己烯雙環(huán)氧化物(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)、環(huán)磷酰胺等，其中VCD可以特異性地加速小鼠和大鼠中原始卵泡和初級卵泡的閉鎖，直至耗盡原始卵泡。另外，順鉑作為一種廣泛使用的抗癌藥物，其因過度激活原始卵泡的緣故也常被用來誘導(dǎo)POF模型[18]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)中收集外泌體可能用于治療順鉑誘導(dǎo)的POF小鼠模型。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是具有不同分化潛能的細(xì)胞亞群，是干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。干細(xì)胞具有自我更新和再生的潛力，干細(xì)胞療法也被認(rèn)為是潛在修復(fù)和恢復(fù)受損組織正常功能的潛在替代療法，這也為POF的臨床治療提供了一種新方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)由于其分離，培養(yǎng)和擴(kuò)增的簡便性，被認(rèn)為是干細(xì)胞治療中最有希望的接種細(xì)胞。研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)脊髓、心肌和皮膚損傷[19]。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效恢復(fù)大鼠卵巢受損組織的結(jié)構(gòu)和功能，并抑制GCs的凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以減慢順鉑誘導(dǎo)的大鼠GCs凋亡。雖然BMSC的工作機(jī)制尚不明確，但有證據(jù)表明其衍生的外泌體中的miRNA可以影響顆粒細(xì)胞的增長，經(jīng)檢測，miR-664-5p被認(rèn)為是BMSC衍生的外泌體中的主要RNA，miR-644-5p在BMSC衍生的外泌體中過度表達(dá)，并通過靶向p53影響卵巢顆粒細(xì)胞的功能，另外，p53、p65和TGF-β之間的轉(zhuǎn)錄合作還調(diào)節(jié)了鼠GCs中miRNA-224的轉(zhuǎn)錄，miR-224的異位表達(dá)通過靶向SMAD4刺激TGF-β1誘導(dǎo)了小鼠GCs增殖，目前雖尚未闡明p53在顆粒細(xì)胞凋亡中的作用，但這些也都在通路、凋亡相關(guān)蛋白和一些相關(guān)基因方面為POF的治療提供了新的策略和方向。

近年來隨著化學(xué)治療劑的研發(fā)和應(yīng)用，腫瘤患者的存活率不斷提高。但相應(yīng)地，由化學(xué)療法誘發(fā)的POF的發(fā)生率也在增加[21]。目前，POF的治療仍未得到有效的突破，也尚無徹底的療法可以逆轉(zhuǎn)化療引起的卵巢結(jié)構(gòu)和功能損害，miR-21作為哺乳動物中最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，與許多細(xì)胞的凋亡調(diào)控有關(guān)，F(xiàn)iedler等[22]在人絨毛膜促性腺激素處理之前和之后4h在小鼠顆粒細(xì)胞中鑒定出13種差異表達(dá)的miRNA。進(jìn)一步的研究表明miR-21可以抑制小鼠排卵性顆粒細(xì)胞的凋亡。有研究還通過構(gòu)建miR-21慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSC并與GCs共同培養(yǎng)，表明miR-21在MSC中的過表達(dá)增強(qiáng)了對化療誘導(dǎo)的POF的療效，其修復(fù)作用的改善可能與靶向PTEN和PDCD4抑制GCs凋亡有關(guān)。這為改善臨床上化療過程中可能引起的卵巢功能問題提供了靶向性依據(jù)并指明了方向。

半胱天冬酶級聯(lián)是凋亡的重要途徑，caspase-8和caspase-9的激活會啟動細(xì)胞凋亡，這會導(dǎo)致凋亡的執(zhí)行者caspase-3裂解并降解底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly(adp-ribose)polymerase，PARP]。研究表明，miR-146a直接靶向IRAK1和TRAF6，通過半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)了卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[23]。此外，胱天蛋白酶抑制劑對胱天蛋白酶級聯(lián)的抑制作用可以減弱miR-146a對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。以上的miRNA對顆粒細(xì)胞的凋亡均具有積極的促進(jìn)作用。這些結(jié)果可能對POF的預(yù)防或治療有很大用處，當(dāng)然關(guān)于其深入的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

四、展 望

miRNA作為一類小型非編碼RNA，廣泛的參與正常狀態(tài)和患病狀態(tài)[24]。單個(gè)miRNA可以抑制數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)基因，并且單個(gè)基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)[25]。現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)也開始聚焦于miRNA過表達(dá)或沉默及其與相關(guān)靶基因或信號通路之間的關(guān)系，以期尋找疾病可能的治療手段。

關(guān)于POF，未來對miRNA在生理性和功能性排卵中作用的研究也會為不育和其他卵巢疾病提供新的診斷和治療策略，由于顆粒細(xì)胞在POF機(jī)制中的重要性，系統(tǒng)地鑒定GCs特異的miRNA將有助于研究人員更好地了解與卵巢疾病有關(guān)的潛在機(jī)制。本文主要描述了miRNA在顆粒細(xì)胞中的作用，以及miRNA在GCs中表達(dá)的研究，并通過靶向特定分子調(diào)節(jié)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如TGF-β、FSH、激素以及細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑等)直接調(diào)節(jié)卵巢卵泡的正常發(fā)育和功能[26]。許多有關(guān)GCs在正常卵巢發(fā)育中的功能以及生殖系統(tǒng)疾病，例如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢早衰的知識在很大程度上是通過臨床研究和臨床前動物模型獲得的。因此通過這些模型和實(shí)驗(yàn)找尋大量相關(guān)的miRNA進(jìn)行研究就尤為重要，對miRNA靶向性和作用機(jī)制的深入了解也將為正常GCs發(fā)育的機(jī)制以及這些具有不同GCs表型的疾病的病因和病理生理學(xué)研究提供有價(jià)值的見解。但盡管如此，調(diào)控POF期間miRNA的表達(dá)和單個(gè)miRNA在顆粒細(xì)胞凋亡中的功能的信號通路仍有待闡明。

實(shí)際上，miRNA對GCs凋亡的作用應(yīng)分為兩類：正調(diào)控的凋亡miRNA和負(fù)調(diào)控的凋亡miRNA。一方面，本文已主要說明了幾種miRNA抑制GCs凋亡的機(jī)制，無論是通過靶向關(guān)鍵蛋白還是激素途徑或影響凋亡信號通路等，都可以起到相應(yīng)的作用。另一方面，也有miRNA作為了GCs凋亡的啟動子，例如，miR-4110通過靶向SMAD2誘導(dǎo)GCs凋亡，miR-23a和miR-27a通過在Fas配體(FasL)-Fas信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中靶向SMAD5促進(jìn)人GCs的凋亡等[27，28]。以上的miRNAs是否影響了對于卵巢早衰中GCs的調(diào)控作用，又是怎樣進(jìn)行的，這些還需要開展深入研究。

目前，對于各種miRNA的篩選及其作用機(jī)制的探討還要更加深入和全面，作用的靶點(diǎn)也對治療有很重要的意義。文中一些miRNA也許能作為POF的診斷、治療或預(yù)后標(biāo)志物，甚至在POF的治療中具有了可能的治療靶向性，但治療性干預(yù)仍需要深入地了解miRNA在調(diào)節(jié)對卵巢激素的生殖反應(yīng)中的作用。