速效救心丸干預(yù)心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及心肌細(xì)胞凋亡

陳亞妮， 高俊杰， 朱文葉， 陳鐵軍， 沈智杰， 王肖龍

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管科，上海　201203）

［藥 理］

速效救心丸干預(yù)心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及心肌細(xì)胞凋亡

陳亞妮， 高俊杰， 朱文葉， 陳鐵軍， 沈智杰， 王肖龍*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管科，上海201203）

目的 觀察速效救心丸（川芎、冰片）對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法 將55只SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，速效救心丸低、中、高劑量組（每組11只）。藥物組給予對(duì)應(yīng)劑量的速效救心丸混懸液灌胃，空白組與模型組給予同等容積的雙蒸水灌胃，連續(xù)灌胃7 d結(jié)束后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血/再灌注大鼠模型。觀察速效救心丸干預(yù)后心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）、細(xì)胞色素C的表達(dá)情況，并采用TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡，HE染色觀察大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 與空白組比較，模型組MPTP開放程度增加，細(xì)胞色素C水平升高（P＜0.05），TUNEL的陽性反應(yīng)面積率顯著上升（P＜0.01）。速效救心丸高、中、低劑量組的TUNEL陽性反應(yīng)面積率等較模型組降低（P＜0.01），但藥物組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。速效救心丸高劑量組的MPTP開放程度（P＜0.05）、細(xì)胞色素C水平（P＜0.01）較模型組降低。結(jié)論 速效救心丸對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制MPTP的開放有關(guān)。

速效救心丸；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞色素C

近年來，急性心肌梗死在我國的發(fā)病率有明顯增高的趨勢。心梗面積的大小對(duì)于心梗病人的死亡率起著決定性的作用。目前最有效的辦法是在心梗發(fā)作后越短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行溶栓或者介入手術(shù)。雖然，再灌注的益處不可否認(rèn)，但是其副作用也不可忽視，包括心肌頓挫、室性心律失常和不可逆的心肌再灌注損傷等，其損傷甚至可能抵消一部分心肌再灌注的好處。越來越多的證據(jù)表明，不可逆的心肌再灌注損傷的機(jī)制可能與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放有關(guān)，該非特異性通道的開放，使線粒體膜電位崩潰，呼吸鏈斷裂，ATP合成分解失衡，細(xì)胞色素C和其他促凋亡因子釋放［1-4］。Argaud等［5］發(fā)現(xiàn)在離體大鼠心臟中，缺血期，MPTP關(guān)閉，但是再灌注時(shí)，MPTP開放。由于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放在心肌再灌注損傷所導(dǎo)致的心肌壞死中是一個(gè)非常重要的過程，因此也為心肌細(xì)胞的保護(hù)提供了可能的靶點(diǎn)。

速效救心丸的臨床療效確切，本課題組發(fā)現(xiàn)速效救心丸可降低急性冠脈綜合征患者冠狀動(dòng)脈介入（PCI）術(shù)后的CK、CK-MB、TnI水平［6］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)缺血/再灌注大鼠的速效救心丸預(yù)處理，從線粒體的角度探討速效救心丸對(duì)缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別健康成年Wistar雄性大鼠55只，體質(zhì)量180～200 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)2007000562281。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 速效救心丸，由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六中藥廠生產(chǎn)（批號(hào)618034）。將速效救心丸碾磨成細(xì)粉，溶解于雙蒸水，制備成質(zhì)量濃度為32 g/L、64 g/L和128 g/L的混懸液。

1.3主要試劑 大鼠細(xì)胞色素C ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；純化線粒體膜通道（MPTP）比色法檢測試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）；DeadEndTMColorimetric TUNEL System（由Promega提供，LOT：0000086338）。

1.4主要儀器 Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標(biāo)儀（芬蘭制造）；微量恒溫器（紹興市衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備制造有限公司）；轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；光學(xué)顯微鏡、熒光過濾器（Olympus）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心電圖儀（日本光電公司生產(chǎn)）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將55只體質(zhì)量180 g左右的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為以下5組：空白組（11只）、模型組（11只）、速效救心丸高劑量組（11只）、速效救心丸中劑量組（11只）、速效救心丸低劑量組（11只）。在造模過程中，因氣道管理不當(dāng)，引起速效救心丸中劑量組死亡大鼠2只。故本課題分組情況為：空白組11只，模型組11只，速效救心丸高劑量組11只、速效救心丸中劑量組9只、速效救心丸低劑量組11只。每組各取3只大鼠石蠟切片。

2.2分組給藥 造模前，根據(jù)“人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算，速效救心丸高劑量為人常規(guī)劑量的兩倍，速效救心丸中劑量為人常規(guī)劑量，速效救心丸低劑量為人常規(guī)劑量的一半。藥物組按高、中、低劑量分別給予速效救心丸混懸劑1.28、0.64、0.32 g/kg灌胃，每日1次?？瞻捉M和模型組給予等量雙蒸水每日1次，定時(shí)灌胃。療程為一周。

2.3動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)［7-8］，將方法略加改良，將大鼠稱定質(zhì)量麻醉固定，暴露氣管，完成插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，感受心尖搏動(dòng)處，切開皮膚，鈍性分離胸部肌肉，打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，在心臟表面動(dòng)脈圓錐與左心耳交界稍下用無創(chuàng)傷縫線穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎部位塞入大小厚度合適的棉條，以防止損傷冠脈，結(jié)扎部位以下心肌變白，活動(dòng)減弱，心電圖提示ST段抬高為缺血成功。結(jié)扎后30 min，打開縫線使血流再通30 min，測心電圖，ST段下降二分之一，發(fā)白部分心肌顏色變紅，為再通成功。取出心臟，于生理鹽水中洗去血污，去除左心室以外組織。

2.4觀測指標(biāo)與檢測方法

2.4.1純化線粒體膜通道（MPTP）開放程度的測定 心肌線粒體提取成功后，立即用分光光度法檢測MPTP開放程度。步驟參照純化線粒體膜通道（MPTP）比色法檢測試劑盒。

2.4.2心肌組織細(xì)胞色素C水平的測定 采用大鼠細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C）ELISA試劑盒。

2.4.3HE染色 取部分心肌組織石蠟包埋、切片，HE染色觀察大鼠心肌形態(tài)變化。

2.4.4心肌細(xì)胞凋亡的測定 取部分心肌組織石蠟包埋、切片，具體步驟參照試劑盒。圖像分析采用Image-Pro軟件，每張片子在凋亡陽性區(qū)域隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)棕黃色染色區(qū)域的反應(yīng)面積為陽性面積，取每組均值進(jìn)行比較。

3　統(tǒng)計(jì)分析

4　結(jié)果

4.1速效救心丸對(duì)心肌組織MPTP的影響 使用CaCl2誘導(dǎo)MPTP的開放，引起A440處線粒體吸光度的降低。如圖1A所示：與空白組相比，模型組CaCl2誘導(dǎo)MPTP開放，線粒體腫脹，吸光度比值（A440/初始A440）隨著時(shí)間下降迅速；與模型組相比，速效救心丸高、中、低劑量組的心肌線粒體的吸光度比值下降緩慢；圖1B示30 min時(shí)吸光度的下降幅度（ΔA440），與空白組相比，模型組下降幅度較大，并與空白組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；與模型組相比，速效救心丸低、中、高劑量組下降幅度較低，但高劑量組與模型組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

4.2速效救心丸對(duì)各組大鼠胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組Cyt-C的表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組相比，速效救心丸低、中劑量組Cyt-C的表達(dá)均有降低的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組相比，速效救心丸高劑量組Cyt-C的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見表1。

4.3TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 空白組光鏡下可見少量凋亡陽性細(xì)胞，組織排列整齊嚴(yán)密。模型組可見細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)邊集等凋亡特征，組織排列紊亂，凋亡陽性細(xì)胞多。與空白組對(duì)比，模型組與藥物組的陽性反應(yīng)面積率升高（P＜0.01）。與模型組相比，藥物組的陽性反應(yīng)面積率降低（P＜0.01）。速效救心丸低劑量組、中劑量組與速效高劑量組之間的陽性反應(yīng)面積率無差異（P＞0.05），見表2。

圖1　速效救心丸對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的影響Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pills on CaCl2-induced MPTP opening

表1　各組細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

表1　各組細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）動(dòng)物數(shù)細(xì)胞色素C表達(dá)量空白組8 391.38±47.90模型組8 471.66±43.69*速效救心丸低劑量0.32 8 422.57±76.17速效救心丸中劑量0.64 6 413.32±38.53速效救心丸高劑量1.28 8 348.42±43.41##

表2　各組心肌組織細(xì)胞凋亡TUNEL陽性面積率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

表2　各組心肌組織細(xì)胞凋亡TUNEL陽性面積率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）動(dòng)物數(shù)陽性反應(yīng)面積率空白組—3 0.98±0.34模型組—3 6.09±0.62**速效救心丸低劑量組0.32 3 3.34±0.20##**速效救心丸中劑量組0.64 3 3.46+0.21##**速效救心丸高劑量組1.28 3 3.26+0.37##**

4.4HE染色結(jié)果 通過HE染色進(jìn)一步觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)及炎性細(xì)胞浸潤的情況?？瞻捉M可見正常心肌細(xì)胞無水腫、肥大、變形和壞死，心肌纖維排列整齊清晰，細(xì)胞核無固縮，細(xì)胞膜完整。與空白組相比，模型組大鼠心肌纖維組織紊亂，部分溶解斷裂，間質(zhì)內(nèi)見水腫變性，細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞染色不均勻。速效救心丸低劑量組與模型組無太大差異。速效救心丸中劑量組及速效救心丸高劑量組心肌纖維斷裂溶解，間質(zhì)內(nèi)水腫情況較模型組減輕。見圖2。

圖2　各組心肌HE染色（×100）Fig.2 Morphological changes（HE staining×100）

5　討論

缺血性心臟病已成為全世界最主要的死亡原因之一。冠脈血運(yùn)重建可以減少心肌的壞死面積，改善心功能，但是在血運(yùn)重建的同時(shí)，常常伴有再灌注引起的心肌細(xì)胞進(jìn)一步的壞死，心肌梗死面積增加，稱為心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）。

速效救心丸由川芎、冰片等藥物組成。川芎辛溫，歸肝膽心包經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載川芎能“主中風(fēng)入腦頭痛、寒痹，筋脈緩急”，為臨床治療心脈瘀阻之胸痹心痛之要藥。冰片辛苦微寒，歸心脾肺經(jīng)，《醫(yī)林纂要》記載冰片“性走而不守”，具有開竅醒神，通竅止痛的功效。臨床有實(shí)驗(yàn)證明大劑量的速效救心丸能降低急診PTCA術(shù)后心律失常的發(fā)生率，尤其能減少再灌注后快速室性心律失常，降低惡性心律失常的致死率［9］，但具體機(jī)制不詳。

一些研究證實(shí)線粒體通透性與缺血/再灌注損傷相關(guān)［5，10-12］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象主要是指位于線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)換孔開放，以及隨之而來的離子平衡被打破，基質(zhì)水腫和外膜破裂，激活相關(guān)的凋亡因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡。在缺血/再灌注、心肌梗死后、心肌重組和心衰等病理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，氧化應(yīng)激和ATP合成減少都可引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放。根據(jù)外界刺激的嚴(yán)重程度，決定了MPTP的開放程度，進(jìn)一步?jīng)Q定了細(xì)胞的死亡方式——壞死或者凋亡［13］。當(dāng)外界刺激較重，線粒體上的MPTP持續(xù)性的不可逆的開放，線粒體去極化，大量離子涌入，基質(zhì)水腫，外膜破裂，凋亡因子釋放，ATP耗竭，這種災(zāi)難性的MPTP的開放將使細(xì)胞不可避免大量壞死。當(dāng)外界刺激較輕時(shí)，一部分線粒體上的MPTP一過性的開放，線粒體去極化，基質(zhì)水腫，凋亡因子釋放，ATP仍可由部分未受損的線粒體提供，但是這并不意味著細(xì)胞能避免死亡，線粒體還通過凋亡來介導(dǎo)細(xì)胞死亡。

在本實(shí)驗(yàn)中，速效救心丸預(yù)處理的缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞相比模型組而言，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放程度受到抑制，細(xì)胞色素C的表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡水平降低。速效救心丸的低、中劑量組可以抑制MPTP開放，減少細(xì)胞色素C的表達(dá)，與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而高劑量組與模型組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05和P＜0.01）。而速效救心丸高、中、低劑量組在細(xì)胞凋亡程度上無劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，速效救心丸通過抑制MPTP的開放，保護(hù)線粒體膜功能的完整性，減少細(xì)胞色素C的釋放，以達(dá)到降低缺血/再灌注后細(xì)胞凋亡程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)深入了解速效救心丸的心肌保護(hù)機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床干預(yù)心肌缺血/再灌注損傷，提供一定的客觀依據(jù)。

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Suxiao Jiuxin Pills interfere MPTP and m yocardial cell apoptosis in rats with ischem ia-reperfusion injury

CHEN Ya-ni， GAO Jun-jie， ZHUWen-ye， CHEN Tie-jun， SHEN Zhi-jie， WANG Xiao-long*
（Cardioυascular Department of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIM To explore the interfering effectof Suxiao Jiuxin Pills（Chuanxiong Rhizoma，Borneolum syntheticum）on opening ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）andmyocardial cell apoptosis in ratswith ischemia-reperfusion injury.METHODS Fifty-five SPF level healthy male Wistar rats were randomly divided into five groups（eleven in each），the control group，the model group，the Suxiao Jiuxin Pills low，middle and high dosage groups（receiving Suxiao Jiuxin Pills）.The controlgroup and themodelgroup were treated with purewater.The leftanterior descending branches of ratswere ligatured to cause the ischemia-reperfusionmodel after seven-day treatment.The opening of mitochondrial permeability transition pore and the expression of cytochrome C（Cyt-C）were examined. TUNELmethod was used for cell apoptosis.HE staining for the observation ofmyocardial cellmorphology was carried out.RESULTS Compared with the control group，MPTP opening，Cyt-C and the rate of positive reactive area of TUNEL inmodel group were significantly higher（P＜0.05，P＜0.05，and P＜0.01，respectively）.The ratesof positive reactive area of TUNEL in Suxiao Jiuxin Pills groups（low，middle and high）were markedly lower than those in the model group（P＜0.01）without significant difference among groups.Moreover，the sizes of MPTP opening（P＜0.05）and the expression of Cyt-C（P＜0.01）in Suxiao Jiuxin Pills high dosage group were all lower than those of themodelgroup.CONCLUSION Suxiao Jiuxin Pills have certain protective effect in the treatment of myocardial ischemiareperfusion injury in rats and itsmechanism might be related to inhibitory effect of the MPTP opening.

Suxiao Jiuxin Pills；mitochondrial permeability transition pore（MPTP）；cell apoptosis；cytochrome C

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0469-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.001

2014-11-05

上海市衛(wèi)生局科研基金項(xiàng)目（20114049）；上海市科委立項(xiàng)課題（12401903400）；上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（14DZ2273200）；上海市中醫(yī)發(fā)展辦公室中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)病種項(xiàng)目（ZXbz2012-08）

陳亞妮（1989—），女，碩士生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究。Tel：13788985868，E-mail：458571422@qq.com

王肖龍（1965—），男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心血管病的防治研究。Tel：13501991450，E-mail：wxlqy0214@163.com