荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血脂、炎癥因子及形態(tài)學(xué)變化的影響

周玉娟， 于柏青， 劉春穎， 劉子豪

（1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北　保定　071000；2.河北大學(xué)研究生學(xué)院，河北　保定　071000；3.河北大學(xué)臨床學(xué)院，河北　保定　071000）

荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血脂、炎癥因子及形態(tài)學(xué)變化的影響

周玉娟1， 于柏青2， 劉春穎1， 劉子豪3

（1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北保定071000；2.河北大學(xué)研究生學(xué)院，河北保定071000；3.河北大學(xué)臨床學(xué)院，河北保定071000）

目的 研究荷丹片（荷葉，丹參，山楂，番瀉葉，補(bǔ)骨脂）對(duì)載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠的血脂、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子（TNF-α）、高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和形態(tài)學(xué)變化的影響。方法 將50只APOE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組。對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，其余各組高膽固醇飼料喂養(yǎng)。12周后，取血清測(cè)血脂，ELISA法測(cè)脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP水平；取同部位主動(dòng)脈HE染色光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組血脂、TNF-α、hs-CRP水平明顯升高（P＜0.01），脂聯(lián)素水平明顯降低（P＜0.01），主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)病變加重。與模型組相比，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組的血脂、TNF-α、hs-CRP水平明顯降低（P＜0.01），脂聯(lián)素水平明顯升高（P＜0.05），主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)病變有所減輕。結(jié)論 荷丹片可降低APOE-/-小鼠血脂和TNF-α、hs-CRP水平，升高脂聯(lián)素水平，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

荷丹片；動(dòng)脈粥樣硬化；載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠；血脂；脂聯(lián)素；TNF-α；hs-CRP；形態(tài)學(xué)變化

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis）是心血管病和腦血管病的主要形式，在全球死亡率最高［1］。而其重要的發(fā)病學(xué)理論是炎癥學(xué)說(shuō)，脂聯(lián)素、TNF-α、高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的炎癥過(guò)程中起著重要作用。從中醫(yī)角度講，動(dòng)脈粥樣硬化的病理性質(zhì)多為瘀毒阻于脈絡(luò)，即瘀毒阻脈是動(dòng)脈粥樣硬化的病機(jī)關(guān)鍵。荷丹片是一種復(fù)方調(diào)脂中藥，具有升清降濁，補(bǔ)益肝腎，化痰祛瘀的作用。本研究選用荷丹片（荷葉，丹參，山楂，番瀉葉，補(bǔ)骨脂），觀察其對(duì)載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠血脂、脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP以及主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響，來(lái)探討荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只8周齡健康清潔級(jí)APOE-/-小鼠（C57BL/6J背景），雌雄各半，平均體質(zhì)量為（18.46±1.66）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為：SCXK（京）2013-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 荷丹片（南昌濟(jì)順制藥有限公司，批號(hào)20130306）；辛伐他汀片（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)1301033）；膽固醇（賽爾克生物公司，批號(hào)130101）；中性甲醛固定液（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究生實(shí)驗(yàn)室配制）；TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒（浙江東甌生物工程有限公司）；脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-2000分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司）；ZHWY-110X恒溫水浴箱（上海智域分析儀器制造有限公司）；BCD-252NJV冰箱（蘇州三星電子）；KD-BM生物包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；LEICA RM2126切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司）；OlympusBX50光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Model680酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型制備 50只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照組正常飼料喂養(yǎng)，其余各組均高膽固醇（1.25%膽固醇）繁殖飼料喂養(yǎng)［2］建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。荷丹片低、高劑量組分別灌胃0.65 g/（kg·d）、2.60 g/（kg·d）荷丹片，辛伐他汀組灌胃6 mg/（kg·d）辛伐他汀。對(duì)照組、模型組每日灌胃等體積生理鹽水，每周稱定體質(zhì)量調(diào)整劑量，共12周。

1.4.2取材 12周末小鼠空腹12 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，分離血清，-20℃保存用于血清學(xué)分析。分離主動(dòng)脈，置于4℃冰鹽水中沖洗。在相同部位取一段長(zhǎng)約1 cm的主動(dòng)脈，于4%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，自主動(dòng)脈根部向下行連續(xù)切片，厚5μm，HE染色。

1.4.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法 光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化；比色法測(cè)定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平；ELISA法測(cè)定血清脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析的方法，以P＜0.05為差異有顯著性；兩兩組間比較，方差齊采用LSD方法，方差不齊則采用DunnettT3方法，以P＜0.05為差異有顯著性。

2　結(jié)果

2.1荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血脂的影響 與對(duì)照組相比，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.01），HDL-C水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組血清TC、TG、LDL-C明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），HDL-C顯著升高（P＜0.01）；與辛伐他汀組相比，荷丹片低劑量組TC、TG水平明顯升高（P＜0.01），LDL-C、HDL-C與之無(wú)顯著差異（P＞0.05）。荷丹片高劑量組與之無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見表1。

表1　荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血脂的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Hedan Tablets on serum lipid of APOE-/-m ice（±s，n=10）

表1　荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血脂的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Hedan Tablets on serum lipid of APOE-/-m ice（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與辛伐他汀組比較，#P＜0.05

組別動(dòng)物/只TC/（mmol·L-1）TG/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）對(duì)照組10 11.09±1.40 0.95±0.08 7.43±1.26 1.71±0.43模型組10 22.13±2.61△1.39±0.15△14.01±2.49△0.94±0.19△荷丹片低劑量組10 16.81±1.43*#1.12±0.11*#10.22±2.60*1.51±0.31*荷丹片高劑量組10 13.13±1.85*0.97±0.07*8.25±1.36*1.76±0.35*辛伐他汀組10 12.80±1.67*0.99±0.08*7.82±1.20*1.72±0.25*

2.2荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血清脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP的影響 與對(duì)照組相比，模型組TNF-α、hs-CRP水平明顯升高（P＜0.01），脂聯(lián)素水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組TNF-α、hs-CRP水平明顯降低（P＜0.01），脂聯(lián)素水平明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與辛伐他汀組相比，荷丹片低劑量組TNF-α、hs-CRP水平明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），脂聯(lián)素水平明顯降低（P＜0.05）。荷丹片高劑量組與之無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2　荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血清脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Hedan Tablets on adiponectin，TNF-α，hs-CRP of APOE-/-m ice（±s，n=10）

表2　荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠血清脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Hedan Tablets on adiponectin，TNF-α，hs-CRP of APOE-/-m ice（±s，n=10）

注：與對(duì)照組相比，△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05；與辛伐他汀組相比，#P＜0.05

組別動(dòng)物/只脂聯(lián)素/（ng·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）hs-CRP/（mg·mL-1）對(duì)照組10 851.08±38.92 285.85±27.30 2.62±0.37模型組10 784.86±36.10△396.10±36.94△3.47±0.28△荷丹片低劑量組10 821.06±28.21*#334.08±37.48*#2.96±0.30*#荷丹片高劑量組10 850.26±39.68*289.54±14.23*2.66±0.18*辛伐他汀組10 859.07±47.03*278.58±21.26*2.64±0.24*

2.3荷丹片對(duì)APOE-/-小鼠形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組血管內(nèi)膜輕度增厚，內(nèi)皮不光滑，可見少量泡沫細(xì)胞，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移。模型組動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹窄，為粥樣斑塊期病變。纖維帽下為大量粉染的無(wú)定形物質(zhì)（細(xì)胞外脂質(zhì)和壞死細(xì)胞）和針狀空隙（膽固醇結(jié)晶）。斑塊內(nèi)有大量的泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。斑塊處中膜內(nèi)靠近內(nèi)彈性膜的細(xì)胞長(zhǎng)軸垂直于內(nèi)膜，受累的中膜空泡變性。荷丹片低劑量組血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮不光滑，斑塊內(nèi)有大量泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。斑塊受累的中膜空泡變性，平滑肌排列紊亂。荷丹片高劑量組和辛伐他汀組均較模型組、荷丹片低劑量組明顯好轉(zhuǎn)，血管內(nèi)膜增厚，斑塊內(nèi)有泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂。見圖1。

3　討論

APOE-/-小鼠因apoE失效使得LDL、VLDL/ IDL等不能與相關(guān)受體識(shí)別結(jié)合，以致這些脂蛋白清除延緩而出現(xiàn)高脂血癥［3］。APOE-/-小鼠斑塊分布及病理特征與人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊很相似，因此APOE-/-小鼠是研究動(dòng)脈粥樣硬化病程及干預(yù)效果的較理想的動(dòng)物模型［4］。已有研究證明荷丹片能調(diào)節(jié)血脂［5］、抗氧化應(yīng)激［6］從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，本實(shí)驗(yàn)以升清降濁、補(bǔ)益肝腎、化痰祛瘀為原則選用荷丹片，研究其是否通過(guò)對(duì)APOE-/-小鼠血脂及脂聯(lián)素、TNF-α、hs-CRP的影響，進(jìn)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

圖1　各組小鼠動(dòng)脈病理切片（HE染色，×100）Fig.1 Pathological sections of aorta in Hedan Tablets groups and Simvastatin group（HE stain，×100）

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，健康的中年個(gè)體中，脂聯(lián)素濃度與冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增厚呈負(fù)相關(guān)。與無(wú)臨床事件的患者比，患有冠狀動(dòng)脈疾病的個(gè)體脂聯(lián)素水平更低［7］。脂聯(lián)素能特異性地抑制TNF-α誘導(dǎo)ⅠκB-α-NF-κB通路的激活［8］。NF-κB的激活誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子，如ICAM-1，E-選擇素，VCAM-1，進(jìn)而招募白細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)［9-10］。白細(xì)胞的異常黏附血管壁對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展至關(guān)重要［9］。因此，脂聯(lián)素能通過(guò)抑制NF-κB通路抑制黏附因子的表達(dá)，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展進(jìn)程中內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。Ouchi等［11］的研究表明脂聯(lián)素可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞A類清道夫受體（MSR）的表達(dá)來(lái)?yè)?dān)當(dāng)泡沫細(xì)胞形成的負(fù)分泌調(diào)節(jié)器，從而抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。臨床研究［12］也發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可能通過(guò)減少TNF-α的生成從而抑制CRP、IL-6的表達(dá)，因此有助于減弱炎癥反應(yīng)。

TNF-α是一種主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，參與機(jī)體的急、慢性炎癥過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TNF-α等炎癥介質(zhì)可增強(qiáng)LDL與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附結(jié)合，促進(jìn)LDL受體基因的表達(dá)，抑制脂蛋白酶的活性等，導(dǎo)致脂代謝的紊亂［7］。TNF-α還能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路NF-κB，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子如ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素的表達(dá)，使單核細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展［13］。

Ridker等報(bào)道指出CRP是未來(lái)心血管病危險(xiǎn)的最強(qiáng)有力的預(yù)示物［14］。CRP與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的可能機(jī)制［7］包括：①CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而啟動(dòng)和加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展；②CRP通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)脈壁中的脂質(zhì)而參與泡沫細(xì)胞的形成；③CRP可誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成組織因子或通過(guò)激活補(bǔ)體，促進(jìn)血栓形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷丹片通過(guò)降低血脂水平，下調(diào)TNF-α、hs-CRP水平，上調(diào)脂聯(lián)素水平，減弱炎癥反應(yīng)，抑制單核細(xì)胞聚集、減少內(nèi)皮損傷和泡沫細(xì)胞生成，預(yù)防動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展，這可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

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Effects of Hedan Tablets on serum lipid，inflammatory factor and morphological changes of APOE-/-M ice

ZHOU Yu-juan1， YU Bai-qing2， LIU Chun-ying1， LIU Zi-hao3
（1.Basic Medical College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China；2.Graduate College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China；3.Clinical College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China）

AIM To investigate the effects of Hedan Tablets（Nelumbinis Folium，Salυiaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Crataegi Fructus，Sennae Folium，Psoraleae Fructus）on serum lipid，adiponectin，TNF-α，hs-CRP and morphological changes of APOE-/-mice.METHODS Fifty APOE-/-mice were randomly divided into normal control group，themodel group，Hedan Tablets low and high dose groups and Simvastatin group.Mice in the control group were given ordinary chow and mice in other groups were given high cholesterol diet.After twelve weeks，mice were sacrificed to measure serum lipid.Adiponectin，TNF-α，hs-CRP were measured by ELISA. Morphological changes in aorta were observed under the lightmicroscope.RESULTS Compared with the control group，the serum lipid，TNF-α，hs-CRP significantly increased（P＜0.01），adiponectin significantly decreased（P＜0.01）and aortic morphology lesions were serious in themodel group.Compared with themodel group，the serum lipid，TNF-α，hs-CRP significantly decreased（P＜0.01），adiponectin significantly increased（P＜0.05）and aortic morphology lesions were reduced in Hedan Tablets groups and Simvastatin group.CONCLUSION Hedan Tablets can reduce the levels of serum lipid，TNF-α，hs-CRPwhile increase adiponectin level of APOE-/-mice，and then inhibit the formation of atherosclerosis.

Hedan Tablets；atherosclerosis；APOE-/-mouse；serum lipid；adiponectin；TNF-α；hs-CRP；morphological change

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0497-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.007

2014-05-26

河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科專項(xiàng)基金建設(shè)項(xiàng)目（2012A3001）

周玉娟（1964—），女，碩士，教授，從事心血管藥理學(xué)研究。Tel：（0312）5075538，E-mail：zyj@hbu.edu.cn