唾液檢測早期診斷口腔癌的研究進展

朱 慧 俞光巖

作者單位：100081 北京大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科（俞光巖為通訊作者）

口腔癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）約占90%。盡管外科手術(shù)、放化療等治療方式不斷進步，OSCC 的5 年生存率徘徊在60%左右，未見顯著提高[1]，重要原因是2/3 以上的患者在初診時已屆腫瘤晚期。

唾液中含有多種與OSCC 相關(guān)的生物標志物，與血漿的成分常具有平行性[2]。高通量和高靈敏度檢測方法的出現(xiàn)解決了唾液中生物標志物濃度較低的問題。唾液與口腔癌病變部位直接接觸，癌瘤表面壞死的細胞可直接脫落進入口腔，腫瘤細胞分泌的外泌體或其他分子也可以通過主動、被動運輸?shù)韧緩綕B入唾液，且唾液易于收集、無侵入性，可以實時動態(tài)監(jiān)測疾病變化，從而使唾液檢測成為高效的OSCC 早期診斷的篩選工具[3]。

本文通過對PubMed、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫進行檢索，收集近五年的研究性文獻，聚焦循環(huán)腫瘤DNA、細胞外囊泡和循環(huán)腫瘤細胞，綜述相關(guān)研究的最新進展。

一、循環(huán)腫瘤DNA（circulating cell-free tumor DNA，ctDNA）

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生理細胞更新或特定病理狀態(tài)下，凋亡、焦亡、壞死細胞或活細胞釋放入循環(huán)中的DNA[4]。正常狀態(tài)下，cfDNA 會被吞噬細胞降解。但在癌癥患者中，此機制受損，導(dǎo)致cfDNA 在體液中累積[5]。由腫瘤細胞釋放的DNA 稱ctDNA，可反映腫瘤DNA 甲基化、點突變和微衛(wèi)星改變等變化[6]，與病變組織的遺傳學改變相關(guān)[2]。ctDNA 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不明確。癌細胞的轉(zhuǎn)化可能是正常細胞內(nèi)化包含ctDNA 的囊泡，或直接接受循環(huán)中由原發(fā)灶腫瘤細胞主動釋放的ctDNA 后形成的[7，8]。因此，ctDNA 很可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的媒介。

ctDNA 的水平可以反映腫瘤負荷、進行預(yù)后判斷及監(jiān)測腫瘤切除術(shù)后腫瘤是否有殘留和復(fù)發(fā)。一般來說，ctDNA 的水平與病變所處時期呈正相關(guān)，且隨疾病進展而迅速增加，并在成功的治療干預(yù)后降低[9]。Desai 等[10]對比44 例口腔癌、40 例口腔癌前病變患者、40 例無口腔病變吸煙者和40 例不吸煙的健康對照者血漿的cfDNA 水平，發(fā)現(xiàn)口腔癌組的總cfDNA 水平更高，且總cfDNA 水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.001） 和臨床分期（P＝0.006） 呈正相關(guān)。Mazurek 等[11]對200 例頭頸鱗癌患者血漿的總cfDNA 水平進行測定，結(jié)果顯示，與正常對照相比，腫瘤患者的cfDNA 水平增加，口咽癌患者增加更為顯著。Lin 等[5]的結(jié)果也支持了血清cfDNA 水平越高，OSCC 患者的預(yù)后越差這一觀點。cfDNA 的水平會受炎癥、吸煙、免疫等多種因素影響，而ctDNA 更具特異性。雖然ctDNA 主要釋放入血液，但可以通過唾液腺的超濾作用、局部病灶主動或被動運輸?shù)榷喾N途徑在唾液中富集[12]。唾液中富含來自口腔腫瘤的DNA，而血清則富含來自其他部位腫瘤的DNA[13]。因此，在口腔癌中，唾液ctDNA 檢測的敏感性高于血清[13]。Wang 等[13]報告，口腔癌患者唾液中ctDNA 的檢出率為100%，高于其他部位的頭頸鱗癌患者，且腫瘤復(fù)發(fā)患者的ctDNA 改變先于影像學改變，這提示唾液ctDNA 檢測可用于口腔癌的早期診斷和腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測。

ctDNA 不僅可作為腫瘤的生物標志物，也可以用于腫瘤異質(zhì)性的鑒別[14]。ctDNA 攜帶的遺傳學改變信息對口腔癌發(fā)生的分子機制的研究有重要意義。Schr?ck 等[15]的研究結(jié)果顯示，血清中ctDNA 甲基化的檢測可有效應(yīng)用于頭頸鱗癌的診斷和患者預(yù)后的評估。SHOX2 和SPEPT9 兩個基因甲基化作為腫瘤的生物標志物已在649 例頭頸癌患者的前瞻性隊列研究中得到驗證，ctDNA 的甲基化水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和死亡率有關(guān)，且在臨床出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移前即可檢測到ctDNA 甲基化水平的升高[15，16]。有學者報告，OSCC 患者的腫瘤組織及血清中的ctDNA 都存在著微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且與腫瘤分期相關(guān)[17]。ctDNA也被用于腫瘤的耐藥性監(jiān)測[18]及腫瘤患者對治療反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測[19]。但ctDNA 在癌前病變患者中的應(yīng)用價值有待進一步研究。

二、細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）

EVs 可以分為兩類：一類是通過出芽直接從細胞膜脫落的微泡，包括直徑約50nm 至1μm 的微囊泡、微粒和大囊泡；另一類是外泌體，大小約30～150nm，由多囊泡體與質(zhì)膜融合時通過胞吐作用釋放[20]。在不少研究中，存在著外泌體和EVs 名稱混用的現(xiàn)象，而目前的分離純化技術(shù)可以鑒定不同類型的囊泡，因此有學者建議使用囊泡亞型名稱以示區(qū)分[21]。研究表明，EVs 通過表面配體與靶細胞受體的識別結(jié)合、內(nèi)吞作用或與質(zhì)膜融合釋放內(nèi)含物等方式，參與細胞間的信息交流，調(diào)節(jié)細胞生命活動，介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，進而調(diào)控腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[22～24]。腫瘤來源的EVs 還可以通過免疫抑制和免疫刺激信號與免疫細胞交流從而調(diào)控腫瘤的發(fā)展[25]。

有學者致力于研究EVs 對腫瘤早期診斷的作用。EVs 富含多種miRNA，通過直接與鄰近細胞或經(jīng)血液循環(huán)與遠處細胞信息交流調(diào)節(jié)腫瘤生長及侵襲。miRNA 具有組織特異性，在不同腫瘤中表達不同，在不同來源的外泌體中表達也有差異。與口腔癌相關(guān)、表達上調(diào)的miRNA有miR-21，miR-455-5p，miR-155-5p ，miR-372 ，miR-373 ，miR-29b ，miR-1246，miR-196a 和miR-181，而表達下調(diào)的miRNA 有 miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17 和miR-125b[26]。Rabinowits 等[27]報告，外泌體中miRNA 的表達模式比循環(huán)游離miRNA 更貼近腫瘤組織中miRNA 的表達，因此認為將外泌體中的miRNA 作為生物標志物信度更高。通過檢測唾液外泌體中差異表達的miRNA，可以實現(xiàn)對口腔癌的早期診斷。但是目前沒有明確的、可用于臨床檢測的miRNA 分子，對唾液來源的腫瘤外泌體的內(nèi)含物的研究報道也較少。

miR-21 是研究較多的生物標志物，在OSCC 患者的外泌體中表達增高。Li 等[28]的研究結(jié)果顯示，低氧微環(huán)境可以刺激腫瘤細胞產(chǎn)生富含miR-21 的外泌體，促進腫瘤細胞遷移。Liu[29]和Chen 等[30]的研究均顯示EVs 介導(dǎo)的順鉑耐藥性與miR-21 有關(guān)。miR-21 與促炎促腫瘤微環(huán)境的建立密不可分。Momen-Heravi 等[31]報告，單核細胞攝取富含miR-21的EVs 后，激活NF-κB 途徑，增加白細胞介素-6、趨化因子CCL-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 等促炎因子的表達，從而促進炎癥過程和腫瘤發(fā)展。陳瑩[32]的研究結(jié)果顯示，OSCC 患者血液和唾液來源的EVs 中，miR-21-5p 的表達趨勢基本一致，呈正相關(guān)（R2＝0.6951），Pearson 相關(guān)性為0.834（P＜0.05），且OSCC患者唾液EVs 中miR-21-5p 的表達水平在術(shù)后顯著降低，可以用于預(yù)后判斷。Dioguardi 等[26]對miR-21 用于口腔癌的早期診斷進行了系統(tǒng)評價和薈萃分析，其靈敏度為0.771（95%CI 0.680～0.842）（P＜0.001），而特異性為0.663（95%CI 0.538～0.770）（P＜0.001），均顯示了miR-21 作為口腔癌診斷標志物和治療靶點的可能性。Langevin 等[33]對體外培養(yǎng)的頭頸鱗癌4 種細胞系中分離出的外泌體進行了miRNA 測序，篩選其中最廣泛表達的miRNA并在患者唾液中進行驗證。結(jié)果顯示，miR-486-5p與miR-10b-5p 在患者和健康對照組唾液的外泌體中存在差異表達，但敏感度較低。Gai 等[34]分析5 例OSCC 患者和5 例健康對照者唾液外泌體的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p 和miR-517b-3p 僅在OSCC 患者中表達，而miR-512-3p 和miR-412-3p在OSCC 患者中呈現(xiàn)高表達。He 等[35]提出，唾液外泌體中miR-24-3p 是OSCC 潛在的新型腫瘤診斷生物標志物。此外，長非編碼RNA 在OSCC 早期診斷中也有重要意義，但尚未見EVs 中長非編碼RNA與OSCC 關(guān)系的報道[36]。

唾液中的微囊泡也可用于OSCC 的早期診斷。Zhong 等[37]純化并定量分析了65 例OSCC 患者唾液中的微囊泡，并以21 例口腔潰瘍患者和42 例健康志愿者做對照。結(jié)果顯示，OSCC 患者唾液中的微囊泡水平顯著升高，唾液微囊泡水平與OSCC 患者的存活率呈負相關(guān)，提示其可能是OSCC 惡性進展的標志物。

三、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）

CTCs 是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血液循環(huán)中的細胞，攜帶多數(shù)與原發(fā)灶相同的突變譜，參與腫瘤自種植，極有可能是癌癥轉(zhuǎn)移的“先鋒”[38]。在癌癥患者的血液中，CTCs 可以有單細胞或細胞簇兩種形式[39]。CTCs 細胞簇具有免疫逃逸的能力，可以更快地形成種植性腫瘤，在血液中存在的時間短而不易被檢測到[39]。Oliveira-Costa 等[40]研究OSCC 患者的基因表達譜，在對CTCs 的分析中觀察到，PD-L1，HOXB9 和ZNF813 表達增高，BLNK 的表達降低，這一結(jié)果與原發(fā)腫瘤的基因表達譜相符。多項研究結(jié)果表明，CTCs 的水平與口腔癌患者生存率和治療效果相關(guān)[41，42]。對CTCs 表面藥物分子靶點的研究可能有助于精準免疫治療藥物的研發(fā)[3]。

CTCs 主要根據(jù)其分子大小和生物學特性（表面的蛋白質(zhì)標志物）而被分離出來，但與良性上皮細胞不易區(qū)分[2]。在CTCs 檢測技術(shù)中，F(xiàn)DA 批準在臨床使用的是Cell Search 系統(tǒng)，CTCs 對上皮細胞黏附分子抗體及細胞角蛋白8，18 和19 呈陽性表達，CD45 呈陰性表達，但此法可能會丟失CTCs 細胞簇，導(dǎo)致血液中實際CTCs 的總數(shù)偏低[43，44]。無標記慣性微流體途徑（label-free inertial microfluidics approach，LFIMA）克服了這一缺點。Kaoro 等[45]提出采用新一代測序技術(shù)結(jié)合LFTMA 檢測CTCs 和ctDNA，結(jié)果顯示，組合分析CTCs 和ctDNA 可以擴展液體活檢所揭示的基因組譜變化的范圍。Morgan等[46]報告了一種新的方法，即表面增強拉曼光譜散射納米技術(shù)，實現(xiàn)了CTCs 的精準檢測。

CTCs 檢測雖然在腫瘤監(jiān)測、分子靶向治療、藥敏實驗等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但其精確性和對臨床的指導(dǎo)作用有待提高。這依賴于精確的分析技術(shù)和生物信息學工具的利用[47]。目前的研究多限于血樣分析，唾液中是否存在主動釋放的腫瘤細胞尚未可知。