脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)在骨組織工程中應(yīng)用的研究進展

焦俊杰 李永麗 齊遠征 于婉琦 楊詩卉 趙靜輝

作者單位：130021 長春，吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植中心（趙靜輝為通訊作者）

為了解決口腔診療中骨量不足的問題，提出了使用植骨材料成骨的方法解決此問題，同時各種骨替代材料也被相繼提出，如自體骨，人工合成骨替代材料，同種異體骨等。自體骨由于其具有良好的骨誘導(dǎo)性和支架作用，且不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，一直以來被認(rèn)為是植骨的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其來源于患者本身，開辟第二術(shù)區(qū)會增加患者痛苦及手術(shù)風(fēng)險，因此臨床上使用較少。自發(fā)現(xiàn)脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)（demineralized dentin matrix，DDM）具有異位成骨能力并從中提取出骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）之后，脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)就成為了學(xué)者研究的熱點。

一、DDM的組成和制備

DDM來源于人類不行使功能的牙齒，如因正畸拔除的牙齒和拔除的第三磨牙。將來源牙齒去除釉質(zhì)、牙骨質(zhì)和牙髓后，剩余的牙本質(zhì)經(jīng)過脫礦、沖洗、凍干和磨碎等工序就制成DDM[1]。X 線衍射分析顯示DDM中含有四種磷酸鈣，分別為：羥基磷灰石HA、β- 磷酸三鈣、無定型磷酸鈣，磷酸八鈣。其磷酸鈣成分主要由低晶體度HA 組成。DDM中鈣磷的含量和組成模式都與人類骨密質(zhì)相近，這就為DDM作為骨的支架提供了條件[2～4]。同時DDM中還含有膠原基質(zhì)和成骨生長因素，且DDM是一種溶于酸的支架材料，具有良好的生物相容性，因此DDM 是一種理想的骨替代材料[5，6]。

DDM 中富含BMP，BMP 是一種可誘導(dǎo)新生骨形成的生長因子。Bessho 等從人的牙本質(zhì)基質(zhì)中提取出了BMP 并證明其3 周就可以在大鼠肌肉中成骨[7]。Clarkson 等分析了牙本質(zhì)基質(zhì)提取物中含有BMP, 且證明了BMP 是誘導(dǎo)新骨形成的關(guān)鍵提取物[8]。

Calvo-Guirado 等人將拔牙后的人牙齒用智能牙本質(zhì)研磨機Smart Dentin Grinder machine 粉碎研磨后得到能應(yīng)用于臨床的自體牙材料，然后對壓碎牙進行顯微稱重，并進行了掃描電鏡分析。經(jīng)過處理，0.25g 人類牙齒產(chǎn)生1.0ml 的生物材料，第一第二上磨牙與下磨牙的牙重存在顯著差異，研磨壓碎后的牙顆粒間孔隙度增大，粒內(nèi)孔隙度僅為2.533%。磨牙后，產(chǎn)生的材料的數(shù)量增加為原來體積的三倍，牙齒顆粒內(nèi)孔和外孔高達44.48%,以增加血供，支持移植物材料緩慢吸收，支持愈合和替代吸收[9]。使用智能牙本質(zhì)研磨機產(chǎn)生的自體牙材料利用率高，生物性能好，是臨床治療中的理想材料，但目前尚缺少足夠的證據(jù)證明使用智能牙本質(zhì)研磨機產(chǎn)生的自體牙材料能夠應(yīng)用于臨床，故還需要進一步研究。

二、DDM 的性能

1.DDM的生物相容性

DDM自應(yīng)用以來，目前還沒有出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。這也是DDM被廣大學(xué)者寄予厚望的重要原因。Gomes 等人在患有四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病的兔頂骨手術(shù)缺陷中植入兔自身制成的均質(zhì)DDM 并檢測，發(fā)現(xiàn)并沒有出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)且促進了兔新骨的形成，證明了DDM良好的生物相容性[10，11]。Bakhshalian等人將同種異體DDM植入兔子頭骨的外科骨缺損中進行修復(fù)治療，結(jié)果表明同種異體DDM 能顯著增加骨量，且不會引起炎癥反應(yīng)后感染[12]。上述實驗證明了DDM具有良好的生物相容性，是理想的植骨材料。

2.DDM的骨誘導(dǎo)性

Pang 等人比對了自體DDM 和Bio-oss 顆粒在拔牙后牙槽骨增強的效果，組織形態(tài)學(xué)檢測兩組均未發(fā)生感染，穩(wěn)定性良好且形成骨量良好，有較高的新骨形成率，因此脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)可作為Bio-oss的替代品治療骨量不足，證明了自體DDM 良好的骨誘導(dǎo)性[13]。Reis-Filho 等人將人DDM植入大鼠牙槽窩內(nèi)，數(shù)日后通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)在植入點血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達增加，刺激血管形成，促進新骨形成并加速大鼠牙槽的愈合過程[14]。進一步證明了DDM具有骨誘導(dǎo)能力，可以作為骨移植材料。近年來關(guān)于DDM骨誘導(dǎo)性的研究有了新的拓展，Munir A 等人將人類脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)吸附于多聚支架，觀察其對于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞礦化成骨的影響，數(shù)周后發(fā)現(xiàn)DDM 吸附于多聚支架制成的功能化支架使人骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了礦化傾向，功能化支架能夠刺激人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化[15]。這為人類脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)的研究提供了新的思路，DDM與功能化支架的結(jié)合應(yīng)用可能成為今后的研究熱點。以上實驗證明了脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)具有良好的骨誘導(dǎo)性，骨傳導(dǎo)性，可作為植骨材料參與口腔治療。

3.DDM的載體支架作用

DDM 植入體內(nèi)后不僅可防止自身所攜帶的BMP 被體內(nèi)酶類所代謝，還可在與其他活性因子聯(lián)用的情況下作為一種良好的屏障和載體而發(fā)揮作用。DDM具有介孔結(jié)構(gòu)，適合DDM內(nèi)部成分與外界物質(zhì)的交流，是理想載體所應(yīng)具備的性質(zhì)。同時DDM可以構(gòu)成活性因子的緩釋系統(tǒng)，避免活性因子在體內(nèi)代謝，使與成骨相關(guān)的活性因子能夠持續(xù)釋放，形成新骨。Kim 等人將DDM浸泡在多脫氧核糖核酸（PDRN）液體后植入大鼠背部皮膚下觀察DDM和PDRN 聯(lián)合使用誘導(dǎo)軟組織內(nèi)成骨的效果，由于PDRN 為液體相，需要支架，而DDM 具有載體支架作用，故兩者可以結(jié)合使用，通過觀察發(fā)現(xiàn)PDRN在與DDM結(jié)合時能夠誘導(dǎo)骨再生并具有良好的效果[16]。Um IW 等人比較了DDM聯(lián)合重組人骨形成蛋白-2 （recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）治療兔顱骨缺損和無機牛骨ABB 聯(lián)合rhBMP-2 的成骨效果，分為三組進行實驗①DDM 組②DDM/rhBMP-2 組③ABB/rhBMP-2 組，通過觀察發(fā)現(xiàn)DDM聯(lián)合rhBMP-2 應(yīng)用形成的骨量更多[17]，證明了DDM良好的載體支架作用。Um IW等人還比較了不同形態(tài)DDM 支架體外釋放的rhBMP-2 的動力學(xué)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DDM 粉塵釋放rhBMP-2 的效果最為顯著[18]。而rhBMP-2 的臨床應(yīng)用目前還存在爭議，有文獻證明高濃度的rhBMP-2可能會增加癌癥、感染等并發(fā)癥的發(fā)生[19]，因此尋找合適的rhBMP-2 的使用濃度也是目前臨床上需要解決的問題。近兩年有學(xué)者開展了在這方面的實驗研究，Um IW 等人將DDM 聯(lián)合rhBMP-2 中 的rhBMP-2 濃度降低至0.2mg/ml，將其與rhBMP-2 濃度為1.5mg/ml 時的成骨效果進行對比，經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)二者成骨量無統(tǒng)計學(xué)差異[20，21]。因此處于安全性考慮，建議將rhBMP-2 的濃度降至0.2mg/ml。此濃度既能發(fā)揮DDM 的載體支架作用，又能降低rhBMP-2 使用的臨床風(fēng)險。

三、DDM 的臨床應(yīng)用

隨著脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)研究的進展，脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床。2008 年韓國方面就已經(jīng)將DDM投入臨床使用[22]，也已經(jīng)有學(xué)者發(fā)表了多篇臨床病例隨訪，事實證明DDM具有良好的臨床療效。經(jīng)過多年的研究和發(fā)展，DDM目前已經(jīng)成為了一種成熟的臨床材料。

1.DDM治療種植體周圍骨缺損

Kim 等人在對23 例牙槽骨骨量不足的患者進行了植入DDM同期植入種植體的手術(shù)，術(shù)后一年內(nèi)拍攝CBCT 測量種植體穩(wěn)定性，結(jié)果顯示所有部位穩(wěn)定性良好，且無任何并發(fā)癥。在骨移植后4 周進行的組織學(xué)評估中，用rhBMP-2 固定的DDM顯示33%的新骨形成。骨移植后12 周，用rhBMP-2固定的DDM顯示48%的新骨形成。在36 個植入部位中僅有一個出現(xiàn)了骨整合失敗的情況，其余35 個部位均整合情況良好[23]。Kim 等人隨訪了2010 年在韓國首批應(yīng)用脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)治療的5 位患者，隨訪時間平均為5 年5.8 個月，通過CBCT 觀察到已形成的皮質(zhì)骨與植入物保持一致，穩(wěn)定性良好[24]。Kim 等亦隨訪了22 例患者，平均隨訪44 個月，患者將自體牙齒移植塊與種植體共同植入上頜或下頜，手術(shù)后種植體周圍骨的體積和形狀保持良好，邊緣骨丟失很少[25]。崔婷婷等人將DDM 與PRF 結(jié)合使用，觀察其在重建上頜前牙區(qū)骨缺損中的效果，12個月后CT 觀察可見新骨形成效果良好且患者術(shù)后反應(yīng)輕微，可見DDM作為支架材料對于治療種植區(qū)周圍骨缺損具有良好的臨床作用[26]。Umebayashi M等人對一位患有嚴(yán)重牙周炎的52 歲日本男子進行了廣泛的上頜前牙槽骨和雙側(cè)竇底隆突的治療，通過移植APDDM 和顆粒狀松質(zhì)骨和骨髓（PCBM）的混合物進行植骨治療，隨后他接受了植入物支持的全牙弓修復(fù)。通過四年的隨訪發(fā)現(xiàn)，該患者的生理骨量得以保持，且沒有任何并發(fā)癥[27]。在該實驗中DDM發(fā)揮了支架的作用組織了PCBM的快速吸收，獲得了良好的治療效果。以上實驗表明，DDM可用于修復(fù)種植體周圍的骨缺損，其形狀和表面結(jié)構(gòu)都有利于DDM 內(nèi)部物質(zhì)與周圍組織進行持續(xù)地交換，一方面釋放各種生長因子在植體周圍，誘導(dǎo)周圍間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分化，同時表面的多孔疏松結(jié)構(gòu)使得毛細(xì)血管可進入其內(nèi)部提供養(yǎng)分并增強抗感染能力，因此DDM既可增強手術(shù)初期的穩(wěn)定性，又可促進修復(fù)種植體周圍的骨缺損。

2.DDM促進細(xì)胞增殖及成骨分化。

Melling GE 等人將非齲性牙本質(zhì)的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)包裹在脂質(zhì)體中，進行體外實驗，將牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSC）置于含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基上，觀察DDM 對DPSC 促進激活作用，DDM脂質(zhì)體比游離DDM 能更有效地使DPSC 聚集和分化，生物活性牙本質(zhì)生長因子和基質(zhì)（TBF-b1、VEGF）可以從脂質(zhì)體中整合和釋放，促進牙本質(zhì)形成，增強牙本質(zhì)再礦化和激活局部DPSCs，進而延緩牙病的進展，提高修復(fù)體的壽命。脂質(zhì)體是一種優(yōu)良的工具，用于控制和持續(xù)的藥物傳遞，并已被用于傳遞一系列分子，刺激內(nèi)源性修復(fù)。將DDM包裹在脂質(zhì)體中，可以在一段時間內(nèi)持續(xù)、可控、局部地釋放DDM，從而減少對高劑量游離DDM的需求[28]。這一實驗提示了人們新的思路，脂質(zhì)體包裹的DDM可能具有更為良好的促進牙本質(zhì)再礦化能力，可作為今后的研究熱點。Avery SJ 等人用乙二胺四乙酸（EDTA）溶解DDM蛋白質(zhì)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放入其中培養(yǎng)，觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β1）增多[29]。Lee CP等人檢測了脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)提取物對牙髓干細(xì)胞克隆群體的特定生物學(xué)作用，在體外評估DDM 對DPSC 克隆群體的影響。將DPSC 在蛋白水解的DDM 中培養(yǎng)，檢測到凋亡標(biāo)志物半胱天冬酶3 減少，細(xì)胞存活標(biāo)記物Akt1 表達增加和增強礦化基質(zhì)沉積，細(xì)胞保持存活并且在3 天內(nèi)數(shù)量增加。以上實驗證明了DDM成分能夠刺激細(xì)胞擴增，減少凋亡，提高細(xì)胞存活率，促進成骨及成牙分化[30]。

綜上所述，DDM由于其本身的特殊結(jié)構(gòu)和它所含的特有成分，成為了學(xué)者研究的熱點，近年來更是成為了一種熱門的臨床材料。DDM具有良好的骨誘導(dǎo)性和生物相容性，同時具有載體支架作用，多種特性使DDM成為了廣大醫(yī)生治療骨缺損、拔牙位點保存等疾病的首選材料。在上述研究中可知DDM還具有促進DPSC,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化和牙周組織再生的作用，且DDM來源充足簡單，對患者本人不會造成二次傷害，多種特性使DDM 具有更加廣泛的研究前景。