結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制和治療的最新研究進(jìn)展

丁 磊,徐俊馳,邱文娜,李 晉,胥 萍（.蘇州市吳江區(qū)兒童醫(yī)院/蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院吳江院區(qū)檢驗(yàn)科,江蘇蘇州 500;.蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院/蘇州市結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 5007）

結(jié)核病是全球傳染病死亡的首要死因。世界衛(wèi)生組織（WHO）“global tuberculosis report 2018”報(bào)告顯示：2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬(wàn)例，我國(guó)約有90萬(wàn)例，占全球9%；患有利福平耐藥結(jié)核?。╮ifampicin-resistant TB，RR-TB）患者約55.8萬(wàn)例，其中耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant TB，MDR-TB）患者占比82%。我國(guó)患RR-TB/MDR-TB約7.2萬(wàn)例，占全球13%[1]。耐藥結(jié)核病的治療費(fèi)用極高，病死率占全球結(jié)核病死亡率的25%，且出現(xiàn)了對(duì)貝達(dá)喹啉（Bbq）、德拉馬尼（Dlm）等新藥耐藥及無(wú)藥可治的情況[2]。最新估算顯示全球約有23%的人群可能患有潛伏性結(jié)核感染，而每83例患有潛伏性結(jié)核感染的人中就有一人感染耐多藥結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MDR）株，在15歲以下的兒童中，每34例患有潛伏性結(jié)核感染的人中就有一人感染MDR株[3]。這些情況將會(huì)破壞全球結(jié)核病防治的進(jìn)程，耐藥結(jié)核病防治工作已經(jīng)到了刻不容緩的地步。本文將對(duì)近年來(lái)MTB耐藥機(jī)制和治療方案方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MTB耐藥分類

為了適應(yīng)耐藥結(jié)核病防治新形勢(shì)，WHO 于2013年[4]重新修訂了耐藥結(jié)核病的分類和定義，增加了利福平耐藥，分類如下。①單耐藥：對(duì)任何一種一線抗結(jié)核藥耐藥；②多耐藥：對(duì)除利福平和異煙肼以外的任何一種及以上一線抗結(jié)核藥耐藥；③耐多藥：至少同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥；④廣泛耐藥：在耐多藥的基礎(chǔ)上，還對(duì)任意一種氟喹諾酮類藥物和阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素這三種二線注射藥物之一耐藥；⑤利福平耐藥：不論患者對(duì)其他抗結(jié)核藥物是否耐藥，但是通過(guò)表型或基因型方法確定其對(duì)利福平耐藥。

2 MTB耐藥機(jī)制

目前部分闡明的MTB耐藥機(jī)制分為固有性耐藥機(jī)制（主要包括細(xì)胞壁滲透性降低、外排泵作用和細(xì)胞代謝）和獲得性耐藥機(jī)制（靶基因突變），且藥物作用的靶基因突變導(dǎo)致獲得性分子耐藥機(jī)制是MTB耐藥的主要機(jī)制，即獲得性突變是MTB耐藥的主要原因[5-7]。

2.1 固有耐藥機(jī)制

2.1.1 細(xì)胞壁特殊結(jié)構(gòu)：MTB的耐藥機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，與其它病原菌相比，其有獨(dú)特且復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)菌體構(gòu)成強(qiáng)大的保護(hù)屏障，這種構(gòu)造賦予MTB 對(duì)多種抗結(jié)核藥物天然的耐藥性[8]。MTB細(xì)胞壁富含脂類，內(nèi)層主要是分枝菌酸包圍在肽聚糖層外面，外層主要是長(zhǎng)鏈的脂肪酸，使得MTB 對(duì)大多數(shù)抗生素是不通透的[9]。已有研究表明，MTB細(xì)胞壁生物合成的過(guò)程對(duì)生物膜的形成很重要，MTB細(xì)胞壁的脂質(zhì)主要負(fù)責(zé)生物膜的形成，這些生物膜被證明富有自由分枝菌酸，同時(shí)存在耐藥細(xì)胞[10]。Rv0024 編碼肽鏈內(nèi)切酶，作為MTB 中NIpC/p60 蛋白家族第5 成員，主要參與生物膜的形成及耐藥性。研究顯示，非致病性恥垢分枝桿菌菌株在異煙肼和吡嗪酰胺這兩種抗結(jié)核藥物的耐藥性實(shí)驗(yàn)中，Rv0024 基因的表達(dá)水平至少增加了10倍[11]。Wag31 作為DivIVA的同族體，參與細(xì)胞壁生物合成。Wag31 可以和6種脂肪酸與分枝桿菌酸合成相關(guān)的蛋白之間相互作用，包括InhA，AccA3，AccD4，ccD5，MmpL3和Fas。實(shí)驗(yàn)表明恥垢分枝桿菌中 Wag31的表達(dá)水平下調(diào)，可增加恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁對(duì)脂類分子的通透性，進(jìn)而增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)四種脂類抗生素（氯法齊明、利福平、新生霉素、紅霉素）的敏感性[12]。由此可見(jiàn)，找到編碼MTB細(xì)胞壁合成過(guò)程的靶基因，降低其表達(dá)水平是克服抗生素抗性的有效途徑。

2.1.2 藥物外排泵：細(xì)菌對(duì)進(jìn)入其體內(nèi)的抗生素會(huì)進(jìn)行主動(dòng)外排來(lái)減低菌體內(nèi)藥物濃度，這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。細(xì)菌外排泵是位于細(xì)菌質(zhì)膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)有六種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族：MFS，SMR，MATE，ABC，RND，PACE[13]。結(jié)核菌屬中有大約20個(gè)基因被確定為編碼外排泵的相關(guān)基因，主要集中在MFS，RND，SMR[14]。MACHADO 等[15]研究顯示，暴露于低濃度抗生素中的耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌菌株，大多數(shù)外排泵基因表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)核桿菌泛素樣蛋白酶體系統(tǒng)（Mycobacterium tuberulosisubiquitin-like proteinproteaome system,MTB PPS）是由MTB 泛素樣蛋白與MTB 蛋白酶體組成，該系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過(guò)程中所需的輔助因子有Dop，PafA 和Mpa。MTB PPS 主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的選擇性降解，對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝發(fā)揮著重要調(diào)控功能[16]。張帥等[17]研究指出MTB PPS 對(duì)單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌耐藥的產(chǎn)生有影響，其作用機(jī)制可能是通過(guò)單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌外排泵的功能來(lái)調(diào)控的。但關(guān)于MTB PPS是否通過(guò)調(diào)節(jié)MTB 外排泵來(lái)調(diào)控其耐藥性的產(chǎn)生還尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，了解相應(yīng)外排泵蛋白的功能，找到抑制其活性的方法是一種克服抗生素抗性的有效途徑。

2.1.3 MTB細(xì)胞代謝：抗生素誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生有害活性氧（ROS）是一種常見(jiàn)的殺菌途徑。MTB 在使用抗結(jié)核藥物治療后產(chǎn)生抗藥性，因?yàn)樗軌蛑厮艽x網(wǎng)絡(luò)和電子傳遞鏈，從而繞過(guò)抗生素介導(dǎo)的ROS 產(chǎn)物，避免造成自身受到損傷[18，21]。海藻糖是MTB 中含量豐富的非還原葡萄糖二糖，是細(xì)胞表面海藻糖單菌酸(TMM)和海藻糖二菌酸(TDM)的核心成分。MTB 通過(guò)下調(diào)TMM/TDM 并重構(gòu)海藻糖代謝產(chǎn)物從而進(jìn)入非復(fù)制耐藥狀態(tài)[19-20]。LEE等[21]研究表明了MTB 改變其細(xì)胞內(nèi)海藻糖代謝作為一種適應(yīng)性策略，以實(shí)現(xiàn)短暫的藥物耐受，這可能是一種持久的生存策略，并在MTB 抵抗貝達(dá)喹啉、利福平及異煙肼的實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。研究表明在宿主體內(nèi)，MTB 可分解代謝脂質(zhì)，包括膽固醇等作為其主要營(yíng)養(yǎng)成分。脂質(zhì)分解代謝反過(guò)來(lái)又與脂質(zhì)生物合成有關(guān)，這些脂質(zhì)起著能量?jī)?chǔ)存、毒性和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子的作用，是MTB 獨(dú)特而復(fù)雜細(xì)胞壁的組成部分。真核型蛋白激酶G（PknG）主要參與調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌毒力，與底物GarA 通過(guò)蛋白-蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌和其他放線菌的三羧酸循環(huán),缺乏PknG 基因表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌的毒力在小鼠的巨噬細(xì)胞中嚴(yán)重減低[22]。因此，深入研究MTB的細(xì)胞代謝過(guò)程，找到細(xì)胞代謝過(guò)程中的某一限速酶，可能是MTB治療的新靶點(diǎn)。

2.2 獲得性耐藥機(jī)制 獲得性耐藥可能通過(guò)基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移發(fā)生，但在MTB 中通過(guò)質(zhì)?；蚩梢苿?dòng)遺傳原件水平轉(zhuǎn)移耐藥基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，所有目前已知的MTB 獲得性耐藥是通過(guò)抗生素使用的選擇性壓力下染色體突變介導(dǎo)的[7，23]。常見(jiàn)的結(jié)核耐藥相關(guān)基因有：利福平（rpoB）、異煙肼（KatG，inhA，ahpC，kasA，ndh）、乙胺丁醇（embCAB，embR）、吡嗪酰胺（pncA，rspA）、鏈霉素（rpsL，rrs，gidB，whiB7）、阿米卡星/卡那霉素(rrs，eis，whiB7)、乙硫異煙胺（ethA，ethR，inhA，ndh，mshA）、氟喹諾酮類藥物（gyrA，gyrB）、環(huán)絲氨酸（alrA，cycA，ddl）、對(duì)氨基水楊酸（thyA，dfrA，folC，ribD）、卷曲霉素（tlyA，rrs）等。不同基因或相同基因不同位點(diǎn)突變頻率各不相同，所引起的耐藥程度也均有差異。以利福平耐藥為例，超過(guò)96%的利福平耐藥菌株在rpoB 基因81 bp 熱點(diǎn)區(qū)域(密碼子507～533位點(diǎn))發(fā)生突變。最常見(jiàn)的突變發(fā)生在密碼子531 和526，占利福平耐藥株的62.5%～81.1%。531 和526位點(diǎn)突變對(duì)利福平產(chǎn)生高水平耐藥，511，514，522，533 等位點(diǎn)突變對(duì)利福平產(chǎn)生低水平耐藥[24-25]。再以異煙肼耐藥為例：約50%～85%的異煙肼耐藥菌株發(fā)生在katG（315位點(diǎn)）突變，其中katG 基因片段完全缺失約占異煙肼耐藥的8%～25%，另外點(diǎn)突變、堿基對(duì)插入及部分缺失也會(huì)引起異煙肼耐藥[25-26]；約10%～40%的異煙肼耐藥發(fā)生在inhA 突變，當(dāng)katG 和inhA 同時(shí)發(fā)生突變時(shí)，MTB耐異煙肼的能力顯著增強(qiáng)，這種情況約占異煙肼耐藥的20%[25，27]，katG 和inhA 突變是異煙肼耐藥的主要原因，其次是ahpC，kasA，ndh，iniABC，fadE，furA，Rv1592c 和Rv1772[28]。另外，利福平和異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的突變頻率還因地理位置而異，掌握這些結(jié)果有利于更好地了解當(dāng)?shù)啬退幗Y(jié)核病的傳播及演變動(dòng)態(tài)[27,29]。因此詳細(xì)了解MTB耐藥的相應(yīng)靶基因，有利于耐藥結(jié)核病的早期診斷、新藥研發(fā)及制定更加優(yōu)化的治療方案。

3 MTB治療最新進(jìn)展

3.1 化學(xué)藥物治療方案 化療是治療結(jié)核病的首選方法，2008年[30]，2014年[31]，2016年[32]WHO 指南均將抗結(jié)核藥分為5組：2014年將Bbq，Dlm 加入第5組；2016年將5組藥物進(jìn)行重新分類，將口服藥物利福平（RIF）、異煙肼（INH）、吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇（EMB）劃歸一線抗結(jié)核藥,將二線抗結(jié)核藥分為A，B，C，D 四組，其中A組（氟喹諾酮類）、B組（注射用抗結(jié)核藥）、C組（口服抑菌類）為核心二線藥，D組（療效不確切，又分為D1，D2，D3 三個(gè)小組）為非核心附加藥物。

WHO 于2016年更新發(fā)布了“耐藥結(jié)核病治療指南”[32]，第一次推出MDR-TB 短期化療方案。WHO 于2018年8月發(fā)布了“關(guān)于耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療重大變化”[33]的文件，根據(jù)各成員國(guó)通報(bào)的最新數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析，對(duì)耐多藥結(jié)核病長(zhǎng)程治療方案推薦使用的藥物重新分組。2018年12月底發(fā)布指南：耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病的治療(更新版)[34]，對(duì)新的藥物分組進(jìn)行了肯定。短程治療方案（療程為9～12個(gè)月）和長(zhǎng)程治療方案（療程為≥20個(gè)月）各有優(yōu)缺點(diǎn)，二者在設(shè)計(jì)原則、藥物組成、患者適應(yīng)癥、用藥負(fù)擔(dān)等方面均不相同，目前關(guān)于短期治療方案的相關(guān)研究仍在優(yōu)化中[35-36]。

3.2 免疫治療方案 單一的化學(xué)治療難以治愈耐多藥的結(jié)核病，WHO 在20 世紀(jì)90年代提出化學(xué)與免疫治療相結(jié)合的方案，但由于臨床上免疫制劑的選擇、用量、療程等諸多問(wèn)題，目前免疫治療仍是一種輔助治療手段。免疫治療主要通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)自身免疫、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、活化巨噬細(xì)胞等來(lái)清除體內(nèi)MTB，治療藥物主要包括：疫苗、細(xì)胞因子、抗體、免疫調(diào)節(jié)劑及其它生物制劑等[37]。研究表明細(xì)胞外囊泡（EVs）攜帶微生物組分并在宿主防御感染中起重要作用，MTB RNA 通過(guò)SecA2 依賴性途徑傳遞到巨噬細(xì)胞衍生的EVs中，并且從MTB 感染的巨噬細(xì)胞釋放的EVs 刺激宿主RIG-I/MAVS/TBK1/IRF3 RNA 傳感途徑，導(dǎo)致受體細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素。這些EVs 還以RIG-I/MAVS 依賴性方式促進(jìn)含MTB的吞噬體通過(guò)非經(jīng)典LC3 途徑成熟，增強(qiáng)殺滅細(xì)菌能力[38]。白細(xì)胞介素-32（IL-32）在宿主抵抗諸如MTB 等病原體方面起著重要作用，IL-32 存在6種選擇性剪接亞型，其中IL-32ε 具有最強(qiáng)的抗結(jié)核作用，誘導(dǎo)MTB細(xì)胞凋亡率最高[39]。相信隨著免疫學(xué)研究的發(fā)展，新的免疫治療藥物將在MTB治療中起到至關(guān)重要的作用。

3.3 改變給藥方式或藥量 目前國(guó)內(nèi)關(guān)于常用抗結(jié)核藥物在霧化吸入、氣管內(nèi)給藥、空洞內(nèi)給藥等給藥方式以及藥物超劑量用法等方面形成了專家共識(shí)[40]。SANKHE 等[41]研究新型的肺部給藥系統(tǒng)能增強(qiáng)新的/現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物的功效、增強(qiáng)患者的依從性，從而減少副作用、治療的頻率和治療時(shí)間。Bello-Monroy等[42]研究發(fā)現(xiàn)在感染了MDR株的BALB/C 小鼠中，通過(guò)管飼或氣管內(nèi)途徑高劑量使用利福平和異煙肼，并聯(lián)合重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在降低肝損傷的同時(shí)能起到較好地清除小鼠肺部耐藥結(jié)核菌的效果。新的臨床給藥方式的應(yīng)用雖然取得了一些成效，但仍處于探索階段，因此還需長(zhǎng)期觀察。

3.4 尋找治療新靶點(diǎn) 隨著二代測(cè)序技術(shù)和全蛋白質(zhì)組測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，近年來(lái)大量新的治療靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。一種策略是通過(guò)針對(duì)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)所必需的信號(hào)通路設(shè)計(jì)新的靶向藥物。GroEL2[43]和GuaB2[44]是結(jié)核生長(zhǎng)所必需的分子，現(xiàn)有研究通過(guò)靶向抑制GroEL/ES（HSP60/10）蛋白系統(tǒng)或者GuaB2 蛋白可以減緩結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)。另一種策略則是通過(guò)增加宿主對(duì)結(jié)核桿菌的免疫力，蛋白酪氨酸磷酸酶B（PtpB）是MTB 免疫逃避的重要蛋白，WASHBURN 等[45]人的研究發(fā)現(xiàn)PtpB 抑制劑可有效增加宿主針對(duì)MTB 免疫反應(yīng)，抑制肉芽腫形成使其成為結(jié)核免疫治療的新靶點(diǎn)。還有研究發(fā)現(xiàn)以PD-1為代表的免疫卡控點(diǎn)在結(jié)核感染時(shí)期發(fā)生異常表達(dá)，通過(guò)相應(yīng)的免疫卡控點(diǎn)阻斷抗體很可能為結(jié)核病的治療提供新的治療方向[46]。

4 MTB治療展望

MTB的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，至今為止尚未完全闡明。而新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)對(duì)耐藥結(jié)核病的診斷和新藥研發(fā)均意義重大，因此還需廣大學(xué)者進(jìn)一步深入研究。新藥研發(fā)成本高、周期長(zhǎng)、難度大，全球應(yīng)聯(lián)合起來(lái)，相互協(xié)作，資源共享。政府應(yīng)引起重視，加大人才、資金、設(shè)備投入，加快新藥研發(fā)進(jìn)程。進(jìn)而優(yōu)化治療方案，提高治療效率。另外需加強(qiáng)特效、長(zhǎng)效結(jié)核病疫苗的研發(fā)，包括預(yù)防性和治療性疫苗，從源頭上遏制結(jié)核病的傳播。在關(guān)注耐藥結(jié)核病發(fā)病機(jī)制和研發(fā)新藥的同時(shí)，也要注重耐藥結(jié)核病患者的治療管理，盡可能結(jié)合患者自身情況制定個(gè)體化方案。只有多管齊下，才能最終實(shí)現(xiàn)消滅結(jié)核病的目標(biāo)。