肺腺癌免疫組化標(biāo)記物的臨床應(yīng)用及其與基因突變關(guān)系的研究進(jìn)展

楊翠林 自寶莉 李萍 周開華

作者單位：1. 650000 云南 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院 2. 650000 云南 昆明，昆明市第一人民醫(yī)院呼吸科

肺癌是最常見診斷和導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)約占所有肺癌的80%～85%，腺癌(約占40%～50%)和鱗癌(約占20%～30%)是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型[2-3]。在以前由于治療的局限性，通常不需要對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)一步分類，因此在小樣本中很少區(qū)分腺癌和鱗癌，隨著靶向治療和免疫治療的發(fā)展，不僅改變了治療策略，而且強(qiáng)調(diào)將NSCLC進(jìn)一步分類為特定亞型的重要性[4-5]。在臨床實(shí)踐中，超過60%的肺癌患者就診時已是晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法通過手術(shù)切除進(jìn)行形態(tài)學(xué)診斷，診斷通常僅限于小活檢標(biāo)本或細(xì)胞系標(biāo)本，而小活檢標(biāo)本在形態(tài)學(xué)上往往不足以確定組織學(xué)類型。在上述背景下，結(jié)合2015年世界衛(wèi)生組織更新的肺癌亞分類指南，建議使用免疫組化法進(jìn)一步對非小細(xì)胞肺癌精確分類；TTF-1、NapsinA、CK7和CK5/6、P63、P40分別為肺腺癌和鱗癌標(biāo)記物[3]。本文就肺腺癌免疫組化標(biāo)記物的臨床應(yīng)用及其與基因突變關(guān)系作一綜述。

一、TTF-1的生物學(xué)特征與功能

TTF-1(Thyroid transcription factor-1)是NKx2家族的成員之一，官方全名為(NK-2 homeobox 1 ，NKX2-1)，是一種含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。人類TTF-1由位于14號染色體上的單基因編碼，cDNA克隆實(shí)驗(yàn)表明，TTF-1由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，多個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和選擇性剪接產(chǎn)生5′末端具有異質(zhì)性的mRNAs，3′端有一個較長的非翻譯區(qū)[6]。牛、大鼠、小鼠和人類的TTF-1由371-378個氨基酸組成，分子量在38-42kDa之間，它們的氨基酸序列具有98%相似性，60個氨基酸同源結(jié)構(gòu)域完全保持不變[7]，表明TTF-1具有高度的序列保守。

TTF-1在胚胎發(fā)生過程中調(diào)節(jié)甲狀腺、肺和間腦的基因表達(dá)，研究表明，敲除小鼠中的TTF-1基因會導(dǎo)致幼崽無法同時出現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)和甲狀腺，并且在前腦中具有廣泛的缺陷[8]。肺組織中，TTF-1控制對肺穩(wěn)定和肺宿主防御至關(guān)重要的表面活性蛋白的表達(dá)，通過直接與SP-A、SP-B 、SP-C、Clara細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)和T1的啟動子直接結(jié)合來調(diào)節(jié)表面活性劑蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而確定了肺的譜系特異性發(fā)育[9]。

二、NapsinA的生物學(xué)特征與功能

Napsin A(novel aspartie proteinase A) 是一種天冬氨酸蛋白酶，基因位于染色體19q13.3上，編碼45 kDa的單鏈蛋白和420個氨基酸，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為1 263 bp，Napsin A基因的一級結(jié)構(gòu)由信號肽、前肽區(qū)、功能區(qū)和C末端四部分組成[10]。Giovanna等[11]研究表明，早在妊娠第12周Napsin A就在胎兒肺腺結(jié)構(gòu)中表達(dá)，到妊娠第30周時表達(dá)減少，此時Napsin A的表達(dá)模式與成人肺相似，Napsin A的表達(dá)在病理?xiàng)l件下增加，包括炎癥性疾病和肺發(fā)育不全，這大概是為了糾正功能性肺衰竭。Napsin A廣泛分布于肺泡巨噬細(xì)胞以及Ⅱ型肺泡表面上皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)表面活性劑蛋白B的N端裂解事件，其蛋白水解活性對肺表面活性蛋白的成熟具有誘導(dǎo)作用，以此來維持肺的形態(tài)及功能[12]。

三、CK7的生物學(xué)特征與功能

CK7(細(xì)胞角質(zhì)蛋白7)的相對分子質(zhì)量為54 KDa，主要在腺上皮和移行上皮中表達(dá)，研究表明，幾乎百分之百的肺腺癌表達(dá)CK7，對肺腺癌的診斷具有極高的敏感性，但其特異性較差，大約30%～60%的肺鱗癌也可表達(dá)CK7[13]。此外，CK7在乳腺、胃、胰腺、卵巢、子宮上皮等器官和部位發(fā)生的腺癌中也可表達(dá),因此,在肺腺癌診斷和鑒別診斷時,需聯(lián)合其他特異度較高的抗體如TTF-1、Napsin A共同應(yīng)用。CK7的表達(dá)在肺癌的預(yù)后、與肺癌基因突變的相關(guān)性尚無研究，它的作用主要在腫瘤的診斷方面。

四、TTF-1與NapsinA在肺癌診斷中的價值

NSCLC分類最常用的免疫組化標(biāo)記物有TTF-1、Napsin A、CK5 / 6、P63 和 P40 ，這些標(biāo)記物具有不同的敏感性和特異性[13]。TTF-1被認(rèn)為是最敏感和最特異的標(biāo)記物來定義起源于終末呼吸單位(TRU)的腺癌，其表達(dá)與腫瘤分化程度成反比，即與高分化腫瘤相比，低分化 腫瘤不太可能表達(dá)TTF-1[14-15]，研究表明，約60%～95%的原發(fā)性肺腺癌表達(dá)TTF-1，肺鱗癌幾乎不表達(dá)TTF-1[13,16]。NapsinA是繼TTF-1之后新發(fā)現(xiàn)的另一種肺腺癌免疫組化標(biāo)記物，在約70%～95%的肺腺癌、<3%的鱗癌中表達(dá)，而在小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌、肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，不表達(dá)或呈低表達(dá)[17]。WHO指出，單個肺腺癌標(biāo)記物(TTF-1、NapsinA)和單個鱗癌標(biāo)記物(p40、 p63)的免疫染色足以解決大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌的診斷[18]。由于沒有任何一個標(biāo)記物對肺癌的診斷是完全敏感和特異的，所以需要使用一組抗體來提高診斷的正確率；一般認(rèn)為，TTF-1/p63 在肺腺癌和肺鱗癌中均是一個陽性而另一個陰性,若患者的TTF-1和P63均呈陰性結(jié)果，則認(rèn)定為腺癌；所有缺乏鱗狀細(xì)胞形態(tài)并顯示p63和TTF-1共表達(dá)的腫瘤最好歸類為腺癌[14,19]。

肺是其他轉(zhuǎn)移癌常發(fā)生的器官之一，原發(fā)性肺腺癌常需與轉(zhuǎn)移性腺癌相鑒別。TTF-1被認(rèn)為是原發(fā)性肺腺癌的可靠標(biāo)記物，然而，TTF-1在其他器官的腺癌中也可呈陽性，包括結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等[20-21]。NapsinA在Ⅱ型肺泡細(xì)胞中的表達(dá)可能被TTF-1上調(diào)，較早的研究表明，NapsinA是原發(fā)性肺腺癌的有用標(biāo)記物，NapsinA對診斷原發(fā)性肺腺癌的敏感性較TTF-1稍高。然而，NapsinA并非肺腺癌所獨(dú)有，約79%的乳頭狀腎細(xì)胞癌和34%的腎透明細(xì)胞癌也可表達(dá)。由于單個免疫組化標(biāo)記物很難鑒別原發(fā)性腺癌還是轉(zhuǎn)移性腺癌，有必要將幾種標(biāo)記物結(jié)合起來；此時，利用肺腺癌特異性的標(biāo)記物(TTF1和Napsin A)結(jié)合乳腺癌標(biāo)記物(ERα、PR、GCDFP15、mammaglobin和GATA-3)、腎細(xì)胞癌標(biāo)記物(PAX8)、乳頭狀漿液性腺癌標(biāo)記物(PAX8、PAX2和ER)、胃腸道腺癌標(biāo)記物(CDX2)和前列腺癌標(biāo)記物(NKX3.1)等可與轉(zhuǎn)移性腺癌相鑒別[22]。

總之，TTF-1和Napsin A在原發(fā)性肺腺癌中高表達(dá)，是肺腺癌的兩個特異性標(biāo)志物，它們主要用于肺腺癌和肺鱗癌的診斷及鑒別診斷，以及區(qū)分原發(fā)性肺腺癌和轉(zhuǎn)移性肺腺癌。

五、TTF-1與Napsin A表達(dá)在肺癌患者中生存預(yù)后的價值

TTF-1 和Napsin A作為肺腺癌標(biāo)記物在原發(fā)性肺癌診斷和鑒別診斷中的作用已被充分證明，它們的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)研究已經(jīng)開展，但其在 NSCLC患者中的預(yù)后意義仍存在分歧，大多數(shù)研究集中在TTF-1，少數(shù)研究討論了Napsin A表達(dá)與預(yù)后的意義。

TTF-1與Ki-67增殖活性呈負(fù)相關(guān)，提示TTF-1陽性表達(dá)，可能具有良好的預(yù)后意義。一項(xiàng)動物研究表明，TTF-1的上調(diào)與良好的存活率相關(guān)，而下調(diào)與分化的喪失，腫瘤接種能力的增強(qiáng)和轉(zhuǎn)移潛能的提高有關(guān)[23]。Schilsky等[24]研究表明，TTF-1陽性的患者總生存期明顯長于TTF-1陰性的患者(18個月比9個月，P<0.000 1),在多因素分析中，TTF-1陽性仍然與較好的總體生存率相關(guān)(HR=0.38P<0.000 1)。Li等[25]研究了TTF-1在中國晚期肺腺癌患者中的表達(dá)對預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，在多變量分析中，TTF-1陽性腫瘤患者的中位無進(jìn)展生存期明顯長于TTF-1陰性的患者(22.7個月VS 11.8個月，P<0.000 1)，除了評估TTF-1對晚期肺腺癌患者生存預(yù)后影響外，還研究了TTF-1陽性表達(dá)患者是否比TTF-1陰性患者從培美曲塞化療中獲益更多，結(jié)果顯示TTF-1陽性表達(dá)并不能預(yù)測對培美曲塞化療的療效。一項(xiàng)薈萃分析表明[26]，與TTF-1陰性的非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者相比，TTF-1過表達(dá)的患者生存率明顯提高(HR=0.49，95%CI:0.42～0.57，P<0.000 01)，亞組分析顯示TTF-1表達(dá)與I期(HR=0.65，95%CI:0.50～0.84，P=0.000 8)和Ⅲ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌(HR=0.38，95%CI:0.29～0.49，P<0.000 01)的預(yù)后顯著相關(guān)。

以上研究表明，TTF-1陽性表達(dá)的患者比TTF-1陰性的患者可能有更好的生存率，但TTF-1陽性表達(dá)并不能預(yù)測對化療的療效。

然而，也有學(xué)者認(rèn)為TTF-1很有可能通過增加腫瘤新生血管的生成從而加速肺癌的發(fā)展。生存數(shù)據(jù)方面，有研究表明[27]，在TTF-1陽性和陰性患者中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此研究還分析了TTF-1表達(dá)與Ⅳ期肺癌患者的生存結(jié)局和化療選擇的關(guān)系，并不能確定TTF-1與生存結(jié)果或治療選擇之間的任何相關(guān)性。TTF-1表達(dá)對肺腺癌治療選擇的預(yù)測作用有待前瞻性隨機(jī)研究的驗(yàn)證。

NapsinA在II型肺泡細(xì)胞中的表達(dá)可能被TTF-1上調(diào)，目前關(guān)于NapsinA的表達(dá)和肺癌生存預(yù)后之間的研究較TTF-1的少。來自克羅地亞的一項(xiàng)研究表明[28]，Napsin A陰性的患者相對死亡風(fēng)險高于陽性表達(dá)的患者(P=0.036)。Ma等[29]研究表明，NapsinA的表達(dá)水平是影響肺癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素，高水平的Napsin A表達(dá)與生存呈正相關(guān)，高表達(dá)組和低表達(dá)組的5年OS率分別為87.6%和56.3%，多因素分析顯示，Napsin A高表達(dá)和TTF-1/Napsin A共同表達(dá)是早期肺腺癌患者良好生存的獨(dú)立預(yù)后因素，早期肺腺癌患者術(shù)后應(yīng)行IHC檢測標(biāo)本中的NapsinA表達(dá)水平，其意義不在于鑒別診斷，而在于能更好的判斷預(yù)后。

目前，通過檢測TTF-1與NapsinA的表達(dá)來預(yù)測生存預(yù)后作用未被充分利用，分析原因可能有以下幾個方面。首先，不同研究中對免疫組化染色的質(zhì)量控制不同，包括抗體的來源、方法的選擇、評分系統(tǒng)的選擇、染色結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn)大不相同。此外，在以往的研究中，樣本量相對較小、隨訪時間短、對組織學(xué)和分期缺乏控制，也是影響因素之一。因此，仍需要制定統(tǒng)一的免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)以及在前瞻性隨機(jī)研究中得到證實(shí)。

六、TTF-1與NapsinA表達(dá)與基因突變的相關(guān)性

NSCLC存在不同驅(qū)動基因的突變，EGFR是目前被研究最全面的基因之一，目前的檢測方法不能在臨床上廣泛普及。因此，鑒定可預(yù)測EGFR突變狀態(tài)的其他病理標(biāo)記物在臨床中可能非常有用。日本NEJ002臨床試驗(yàn)報道[30]，在TTF-1 表達(dá)陽性的ADC患者中，EGFR 突變率顯著高于TTF-1陰性表達(dá)者，尤其是亞裔、女性和非吸煙者，顯示出較高的EGFR突變率和TTF-1陽性表達(dá)率，后續(xù)很多研究也發(fā)現(xiàn)， TTF-1的表達(dá)狀態(tài)與肺ADC患者EGFR 突變有關(guān)[31-32]。

Wan等[33]研究表明，在97例EGFR突變的患者中，免疫組化TTF-1染色均陽性，而TTF-1陰性或者部分陽性者無一例EGFR突變。一項(xiàng)薈萃分析[34]評估了NSCLC中 TTF-1表達(dá)與 EGFR突變之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，與TTF-1 表達(dá)陰性的NSCLC相比，攜帶 TTF-1 過表達(dá)的患者，表現(xiàn)出更高的 EGFR 突變率(OR=5.19，95%CI：3.60～7.47，P<0.000 01)，TTF-1 的表達(dá)與外顯子 19(OR=4.63，95%CI：2.89～7.41，P<0.000 01)以及外顯子21(OR=3.16，95%CI：1.04～9.60)的 EGFR 突變顯著相關(guān)(P=0.04)。近期一項(xiàng)研究[32]也表明， TTF-1的表達(dá)水平與EGFR突變(P<0.001)呈正相關(guān)，隨著TTF-1表達(dá)水平增高，突變率也增高，表明不同的TTF-1表達(dá)水平具有不同的EGFR突變率。

Li等[31]回顧性研究了339例肺腺癌患者TTF-1、Napsin A的表達(dá)與EGFR突變情況，研究發(fā)現(xiàn)7.7%的病例為TTF-1、Napsin A雙陰性，且這些病例均未包含 EGFR 突變，這一發(fā)現(xiàn)支持使用TTF-1和NapsinA免疫組化結(jié)果為雙陰性的病例來識別EGFR突變的患者，在小活檢標(biāo)本中可以保留有限的組織用于其他輔助測試。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，肺粘液性腺癌通常無EGFR突變，相反，這些腫瘤最常攜帶KRAS激活突變，而且對TTF-1和Napsin A呈陰性。因此，當(dāng)鑒定出真正的肺粘液性腺癌時，有學(xué)者提出可以避免進(jìn)行 EGFR突變檢測。

七、TTF-1與NapsinA表達(dá)與基因突變相關(guān)性研究的意義

EGFR突變在TTF-1、NapsinA陰性表達(dá)的肺腺癌中有異常罕見，對EGFR突變有很高的陰性預(yù)測價值，當(dāng)由于腫瘤組織不足、取材困難、費(fèi)用昂貴等原因無法及時檢測 EGFR突變狀態(tài)，或者由于臨床原因需要緊急治療時，TTF-1 、NapsinA免疫組化染色結(jié)果在一定程度上可以作為指導(dǎo)EGFR 突變未知的晚期非小細(xì)胞肺癌患者抗癌治療的生物標(biāo)志物。特別是TTF-1陰性表達(dá)，可能是肺腺癌患者推薦常規(guī)化療的替代指標(biāo)，在一定程度上彌補(bǔ)了EGFR基因突變檢測的不足。

小 結(jié)

公認(rèn)的肺腺癌免疫組化標(biāo)記物有TTF-1和Napsin A，它們在非小細(xì)胞肺癌的準(zhǔn)確診斷和亞分類中具有關(guān)鍵作用。但肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和各種蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的表達(dá)，在過去的十多年中，發(fā)現(xiàn)了許多肺癌生物標(biāo)志物，但這些標(biāo)志物在臨床實(shí)踐中并未被充分應(yīng)用，如果這些良好的生物標(biāo)記物能用來判斷肺癌預(yù)后、監(jiān)測疾病進(jìn)展、治療反應(yīng)以及指導(dǎo)靶向治療等，那么這些指標(biāo)的臨床意義就會擴(kuò)大。