外泌體在肺癌診斷中的應(yīng)用研究

郝昱 徐興祥

作者單位：225000 江蘇 揚州，蘇北人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，一直威脅著人類的健康，四分之一的癌癥死亡是肺癌，大多數(shù)肺癌確診時已是晚期階段，5年相對生存率僅有大約16%～19%[1]。肺癌的傳統(tǒng)治療方法是基于組織活檢中癌細胞的組織病理學(xué)分析，但因為其有創(chuàng)性，患者需要承擔較大的風(fēng)險，因此，尋找有效的肺癌早期篩查手段已成為一個亟待解決的問題。外泌體作為液體活檢其中的一種成分，因其獲取的非侵入性、可重復(fù)性、成本低等優(yōu)點用于診斷肺癌已經(jīng)成為一個研究熱點話題[2-3]。目前已經(jīng)有研究表明，外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤微環(huán)境、肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、參與放化療抵抗中，分別都發(fā)揮著重要作用。尤其是外泌體所含的蛋白質(zhì)、miRNA等成分已經(jīng)研究證實對于肺癌的早期診斷有重要價值，具有作為新的早期診斷標記物的潛力。本文主要將從外泌體作為液體活檢標記物在肺癌中的生物學(xué)作用與應(yīng)用于肺癌方面進行綜述。

外泌體概述

在人體的多種體液中都能夠發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，例如腦脊液、唾液、胸腔積液、乳汁、腹水、血液、精液、尿液等。外泌體來源于晚期的內(nèi)吞體，又稱為多囊泡體,(multivesicular bodies, MVB) , 是體內(nèi)活細胞通過內(nèi)吞-融合-外排等一系列生物學(xué)過程而形成的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的多囊泡體, 它們的直徑大約在30～100 nm，密度在1.13～1.19 g/m1。外泌體的生物成分中含有蛋白質(zhì)、核酸(DNA、mRNA、miRNA、其他非編碼RNA)、脂質(zhì)等[4-5]。外泌體最初是在1987年，Johnstone 等人在研究網(wǎng)織紅細胞成熟的過程中，對綿羊紅細胞上清液進行超速離心時發(fā)現(xiàn)的[6]。最初人們認為外泌體是細胞丟棄的“垃圾”，在1995年Raposo等人發(fā)現(xiàn)被EB 病毒感染的 B 淋巴細胞釋放的外泌體攜帶了適應(yīng)性免疫應(yīng)答所需要的膜結(jié)合分子[7]。從而發(fā)現(xiàn)外泌體可能具有改變細胞外微環(huán)境、呈遞抗原、刺激T細胞增殖、誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)等功能。

一、外泌體的生物發(fā)生

外泌體生物發(fā)生最重要的一個機制是ESCRT依賴機制，ESCRT是由四種蛋白質(zhì)復(fù)合物和輔助蛋白質(zhì)組成(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III和Vps4)。這一機制的過程包括從內(nèi)芽形成細胞內(nèi)小體，到多泡小體的產(chǎn)生，到多泡小體的融合成有質(zhì)膜的細胞體，然后將外泌體釋放到胞外[8]。外泌體形成的另一個機制涉及到神經(jīng)酰胺的合成，它誘導(dǎo)囊泡彎曲和出芽[9]。外泌體生物發(fā)生的第三種機制是四跨膜蛋白介導(dǎo)的特定蛋白質(zhì)組織，如淀粉樣蛋白和前黑質(zhì)體蛋白[10]。

二、外泌體的主要成分

已知的一些數(shù)據(jù)庫，如ExoCarta (http://www.exocarta.org)給出了外泌體各種成分較為全面的表述，已研究出外泌體含有41 860種蛋白質(zhì)、3 408種mRNA、2 838種miRNA和1 116種脂質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)外泌體中存在多種蛋白質(zhì)，它們能參與外體的生物發(fā)生(ESCRT復(fù)合物，Alix，TSG101)、抗原提呈(抗原提呈因子)、膜轉(zhuǎn)運和融合(Rab GTPases和膜聯(lián)蛋白)，外泌體還富含熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、整合素、四磷酸腺苷(由CD63、CD9、CD81、CD82和四種跨膜蛋白組成的超家族，它們通常被認為是外泌體標記)、MHC Ⅱ類蛋白、上皮細胞粘附分子(EpCAM)和人類表皮受體家族成員[11-12]。另外外泌體中主要含有膽固醇(CHOL)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二酰甘油(DAG)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)等多種脂質(zhì)成分[13]。miRNA是一系列內(nèi)源性的非編碼小核糖核酸分子(18～22個核糖體)，與mRNA的3′UTR結(jié)合引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。miRNAs可以通過外泌體主動分泌并傳遞給其他細胞或腫瘤細胞，從而保護它們不被降解。外泌體miRNAs能在新的受體細胞中有效地發(fā)揮作用。外泌體的miRNA譜與原發(fā)性腫瘤的miRNA譜具有相似性，外泌體miRNAs的特征可能反映了原始腫瘤細胞的特征，有作為生物標記物的潛能[14]。

外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用

1)促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)：來自缺氧的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)的外泌體miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100通過激活STAT3信號誘導(dǎo)的EMT，促進了肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。2)刺激血管生成：來自于人類肺癌A549細胞的外泌體分揀蛋白(Sortilin)是外泌體在細胞通訊介導(dǎo)中的關(guān)鍵成分，它與原肌球蛋白相關(guān)激酶B(TrkB)、表面生長因子受體(EGFR)組成的TrkB-EGFR-sotilin復(fù)合物也叫做TES復(fù)合物，這種復(fù)合物在體外有遷移和激活內(nèi)皮細胞的功能，從而在促進肺癌血管生成中發(fā)揮重要作用[16]。3)在肺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)：腫瘤來源的外泌體可以與體內(nèi)的免疫系統(tǒng)的正常細胞相互作用，使產(chǎn)生抑制正常免疫作用的異常細胞增多，使抗原提呈細胞(APC)減少、抑制T細胞及NK細胞，從而導(dǎo)致免疫監(jiān)視減少，進一步促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移侵襲[17]。外泌體在肺癌的免疫逃逸過程中發(fā)揮了重要作用。4)促進肺癌轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成：研究者從原發(fā)性小鼠肺癌細胞中收集了外泌體，并從中分泌出RNA，通過II型肺泡上皮細中的NF-κB和MAPK途徑使TLR3(Toll樣受體3)表達上調(diào)，促使趨化因子產(chǎn)生和中性粒細胞聚集，進而促進轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成[18]。

外泌體在肺癌早期診斷中的作用

組織活檢一直作為肺癌診斷的“金標準”，但是其具有創(chuàng)傷性大、依從性差、操作過程復(fù)雜等缺點。外泌體作為一種液體活檢技術(shù)的檢測標記物能夠在人體的多種體液中獲取，有效的反映其親本細胞，具有創(chuàng)傷性小、樣本易獲取，并且能夠?qū)崿F(xiàn)動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點。外泌體的各種生物成分，如miRNA、蛋白質(zhì)等在肺癌中存在異常表達，外泌體的這些生物成分具有作為肺癌診斷標記物的巨大潛力。

一、外泌體蛋白作為肺癌診斷的標記物

ADAM是一種去整合素和金屬蛋白酶，Yoneyama等人的一個首次將酶特異性蛋白水解活性作為潛在的癌癥生物標記物的研究利用PrAMA(蛋白水解酶活性矩陣分析)推斷ADAM10sa(ADAM10 sheddase activity)在非小細胞肺癌患者的外顯體上選擇性增加，這不僅能準確區(qū)分NSCLC腫瘤患者與健康人，而且能準確區(qū)分NSCLC腫瘤患者與炎癥性或良性腫瘤性肺病患者，因此，此種蛋白質(zhì)可作為一種重要的NSCLC檢測生物標記物[19]。為了驗證外泌體蛋白作為生物標志物的潛力，研究者選擇了一組高表達的蛋白，結(jié)果表明，在LLC胞體中CDK1和CDK3含量較高，KRAS在這三種類型的癌細胞的外泌體中均含量豐富，而PPP1CA和CDC42在三種細胞中均未檢測到[11]。外泌體蛋白質(zhì)的種類繁多，針對肺癌診斷的特異性研究較少，不同體液來源的外泌體蛋白質(zhì)都具有作為肺癌標記物的潛能，值得期待的是多種外泌體蛋白質(zhì)組成的聯(lián)合標記物將具有較高的臨床價值。

二、外泌體miRNA作為診斷標記物

miRNA被包裹在微泡或者外泌體中使其能夠穩(wěn)定的存在于體液中，對miRNA的研究分析能夠反應(yīng)親本細胞的狀態(tài)。研究者對12例NSCLC患者和6名健康者的血漿進行外泌體分離，通過qPCR技術(shù)分析了在NSCLC中選擇的8個被解除調(diào)控的特異性miRNA，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿選擇的外泌體miRNA相對于正常健康人的表達上調(diào)或者下調(diào)。由此可見NSCLC患者血漿外泌體miRNA可以作為一種疾病診斷工具[2]。實驗通過同時檢測8種血清miRNA和相應(yīng)的血清外泌體miRNA，發(fā)現(xiàn)了4種血清miRNA(miR-21-5p，miR-1413p，miR -222-3p，miR-486-5p)和2種血清外泌體miRNA(miR-146a-5p的和miR-486-5p)在NSCLC的早期患者中具有診斷價值，進一步研究證明血清外泌體miR-146a-5p和miR486-5p在早期NSCLC診斷中的表現(xiàn)優(yōu)于其相應(yīng)的血清miRNA和其他6種血清miRNA，由此可見在早期NSCLC診斷中血清外泌體miRNA比血清miRNA可能更有價值[20]。隨著對液體活檢技術(shù)的不斷探索，很多研究證實，來源于肺癌的外泌體相關(guān)miRNA在肺癌診斷中有巨大潛力，但是目前來看針對肺癌的外泌體特異性miRNA還很少，外泌體特異性miRNA或者多種miRNA組合作為有效的篩查手段還在進一步的探索狀態(tài)，需要更多的實驗及密切結(jié)合臨床來驗證。

外泌體與肺癌的治療與耐藥

研究發(fā)現(xiàn)當使用不含IFN-γ的樹突狀細胞來源的外泌體治療晚期NSCLC時，外泌體能夠發(fā)揮自然殺傷(NK)細胞的功能，隨之進行的Ⅱ期試驗，更進一步驗證了外泌體可以在NSCLC患者體內(nèi)增強NK細胞抗腫瘤免疫性的能力[21]。研究者發(fā)明了一種用于肺癌治療的金納米顆粒-外泌體(Exo-GNP)的治療性藥物傳遞系統(tǒng)——“nanosomes”，該系統(tǒng)由通過物理上負載在外泌體上的pH可裂解鍵與抗癌藥阿霉素(Dox)偶聯(lián)的GNP組成，該系統(tǒng)的使用比單獨使用Dox相比，具有更快的藥物釋放速率，更低的化療毒性，從而使化療效果增強[22]。不管是固有的還是獲得性的化學(xué)療法產(chǎn)生耐藥性，是癌癥治療中最基本的問題之一，并引起局部和遠處的腫瘤復(fù)發(fā)以及疾病進展。外泌體作為細胞間傳遞信息的信使，研究發(fā)現(xiàn)它在肺癌藥物治療過程中產(chǎn)生耐藥方面也存在它的身影。在非小細胞肺癌中攜帶T790M突變的EGFR-TKI耐藥細胞H1975釋放的外泌體miRNA-522-3p通過激活PI3K/AKT途徑將耐藥特性傳遞給EGFR-TKI敏感細胞PC9，抑制吉非替尼的治療作用、促進PC9細胞對吉非替尼的耐藥，并促進體內(nèi)腫瘤的生長[23]。

總 結(jié)

隨著人類醫(yī)療水平的進步，肺癌的發(fā)病率仍然持續(xù)升高，這與肺癌的發(fā)病因素復(fù)雜密切相關(guān)。盡管肺癌的診斷技術(shù)及治療方案較以往有了較大的進展，但是肺癌的診斷難度大、治療效果不佳，仍然是困擾我們的一大難題，因此尋找更多簡便有效的肺癌診斷及治療方法是一個亟待解決的問題。外泌體作為一種新型的液體活檢標記物，因其包含多種蛋白質(zhì)、核酸等生物成分，可以在細胞之間起到細胞間通訊及調(diào)節(jié)細胞各種生理反應(yīng)等重要作用，肺癌細胞也可以利用外泌體這種細胞間信息傳遞的功能幫助構(gòu)建一個良好的細胞生存的微環(huán)境來支持肺癌細胞自身的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲以及對治療的抵抗。因此外泌體可能作為肺癌早期診斷、治療過程及判斷預(yù)后的動態(tài)標記物。近年來對于外泌體有關(guān)的生物活性物質(zhì)的研究越來越多，但是大部分仍處于實驗階段，面臨許多問題，如樣本數(shù)量受限、標本選擇存在爭議、外泌體分離及提純的標準不確定等。外泌體在肺癌中的應(yīng)用應(yīng)該密切結(jié)合臨床實際情況，全面了解外泌體在肺癌中的發(fā)生作用的機制等，相信隨著未來研究的進展，外泌體的各種生物成分有望成為幫助診斷肺癌的生物標記物，并且在肺癌的治療及預(yù)后方面有著巨大的潛力。