氣道上皮細胞損傷修復(fù)在哮喘中的研究進展

金明珠，陳曉秋綜述 李鈺，曹志偉審校

哮喘是一種常見的慢性炎性反應(yīng)性氣道疾病，全世界有超過3億人患有哮喘，發(fā)病率逐年上升[1]。哮喘的經(jīng)典發(fā)病機制建立在氣道炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，過度的氣道炎性反應(yīng)被認為是推動哮喘發(fā)生發(fā)展的主要病理生理過程。感染、變應(yīng)原刺激是哮喘發(fā)作常見的誘因，哮喘病因非常復(fù)雜，是一種多因素疾病[2]。其中一種為“缺陷上皮”假說，即氣道上皮細胞損傷修復(fù)的缺陷是哮喘的病因之一。事實上，許多損傷因素亦是哮喘發(fā)作的誘因，而且哮喘患者氣道上皮已被證明有損傷存在，屏障完整性受損[3]。以上皮損傷和修復(fù)受損為特征的氣道重塑、網(wǎng)狀基底膜增厚、氣道平滑肌和杯狀細胞肥大、增生及血管生成可與氣道炎性反應(yīng)并行發(fā)生。有研究認為氣道高反應(yīng)性繼發(fā)于上皮損傷[4]，這也進一步支持哮喘的缺陷上皮假說。盡管對哮喘的認識有所進展，目前尚無治療方法能改變疾病的自然病史和進展，關(guān)于氣道上皮細胞損傷修復(fù)的研究或許能對哮喘的治療開拓新的方向。

1 氣道上皮細胞的屏障作用及其損傷修復(fù)

氣道上皮細胞處于肺內(nèi)環(huán)境與外界環(huán)境的交界，是呼吸道抵御外界刺激，如微生物、過敏原等的第一道防線，它維持著肺內(nèi)各種生物學(xué)功能的動態(tài)平衡[5]。了解上皮細胞在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和疾病病理學(xué)中的作用一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點。

人類氣道有多種上皮細胞，根據(jù)細胞結(jié)構(gòu)、生化和功能特性，主要分為3種，包括基底立方上皮細胞、柱狀纖毛上皮細胞和分泌型氣道上皮細胞，它們共同組成假復(fù)層黏膜上皮?；准毎徽J為是上皮細胞中的祖細胞，由其分化成分泌細胞和纖毛上皮細胞[6]；傳導(dǎo)性氣道的大部分上皮細胞是假復(fù)層纖毛柱狀上皮細胞，來源于基底細胞或分泌上皮細胞，是它們的終末分化階段[7]。纖毛細胞的特征是其頂端表面多達300個的纖毛結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)大量的線粒體為纖毛擺動提供能量，這些纖毛以定向的方式，從肺部到喉部清除黏膜上的分泌物及異物；非纖毛上皮細胞，也稱為分泌細胞，包括杯狀細胞、漿液細胞、棒狀細胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞。杯狀細胞主要存在于較大的傳導(dǎo)性氣道中，其特征是分泌黏蛋白顆粒，以捕獲氣道中的異物。漿液細胞雖與杯狀細胞形態(tài)相似，但缺乏黏蛋白糖。棒狀細胞主要產(chǎn)生表面活性劑和其他蛋白質(zhì)成分。越來越多的新近證據(jù)表明，這些細胞發(fā)揮著重要的干細胞作用，即是纖毛細胞和黏液分泌細胞的祖細胞[7]。氣道上皮細胞最重要的功能之一是在損傷后以有效和協(xié)調(diào)的方式驅(qū)動上皮修復(fù)和恢復(fù)屏障的完整性。

作為對損傷的響應(yīng)，氣道上皮必須迅速修復(fù)和再生，以恢復(fù)其完整性和功能，提供對外部環(huán)境的保護屏障及有效的氣體交換。細胞損傷修復(fù)過程的適當(dāng)激活是恢復(fù)和維持上皮屏障功能的關(guān)鍵，這個過程包括初始炎性反應(yīng)、細胞的遷移、增殖和分化、炎性反應(yīng)的分解。這個復(fù)雜過程中的任何缺陷都會導(dǎo)致上皮細胞屏障功能的障礙和肺內(nèi)組織的持續(xù)性損傷。傷口邊緣的分泌上皮細胞具有去分化能力，而纖毛細胞可以轉(zhuǎn)分化為鱗狀細胞以暫時覆蓋被剝落的區(qū)域。相鄰的基底細胞，稱為前緣細胞，能夠迅速擴散和遷移，使傷口再次上皮化，然后增殖和分化[8-9]。在動物模型中，受損基底膜的再上皮化初始過程主要是細胞遷移。盡管修復(fù)的初始階段同時涉及遷移和增殖，但傷口的大小似乎決定了哪個過程占主導(dǎo)地位。遷移可閉合小的損傷，而并不需要細胞增殖。較大的損傷則需要遷移和增殖共同修復(fù)[10]。作為修復(fù)過程的重要組成部分，有效的細胞遷移由高度協(xié)調(diào)的活動組成，它們包括前緣突出、基底黏附、細胞體移位、與基底脫離和后緣收縮。這些修復(fù)過程一直持續(xù)到氣道上皮完全恢復(fù)完整屏障功能的假復(fù)層黏液纖毛上皮。

2 哮喘與氣道上皮細胞的關(guān)系

哮喘患者氣道上皮的異常一直為人們所熟知，對于支氣管上皮的損傷如何導(dǎo)致哮喘患者的支氣管高反應(yīng)性，已有各種理論。人們在哮喘患者的痰液標本中發(fā)現(xiàn)存在Creola小體、大量的脫落氣道上皮細胞，在支氣管活檢中也觀察到氣道上皮細胞的脫落。Creola小體是上皮細胞的碎片，上皮的脫落與碎裂被認為在哮喘發(fā)病中起重要作用。還有研究顯示，氣道的高反應(yīng)性繼發(fā)于上皮損傷。上皮細胞功能缺陷是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素。

2.1 哮喘患者氣道上皮細胞修復(fù)功能變化 對于哮喘患者氣道上皮細胞的損傷愈合能力，多數(shù)研究認為哮喘患者上皮細胞愈合能力明顯低于正常人[11]。研究證明，哮喘氣道上皮細胞具有較強的增殖能力，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)mRNA水平升高，但其修復(fù)功能失調(diào)[12]。另外，哮喘上皮細胞分泌更多的纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1、IL-1β、IL-10及IL-13，這些細胞因子在氣道上皮的增殖、分化和修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[13]。哮喘上皮細胞顯示出更為低分化的表型，而且分化出更多的基底細胞和杯狀細胞，并有p63表達改變。哮喘患者細胞具有較低的跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，細胞間緊密連接減少[14]。表明哮喘患者氣道上皮細胞的屏障功能本身就低于正常人。

有學(xué)者認為氣道上皮是氣道炎性反應(yīng)和重塑的整體調(diào)節(jié)因子[15]，支氣管上皮的損傷可能在哮喘中產(chǎn)生重要的結(jié)構(gòu)和功能影響，導(dǎo)致上皮表型改變，其特點是屏障功能不全、損傷修復(fù)不良、感染后缺乏先天免疫應(yīng)答。有研究顯示，反復(fù)暴露于屋塵螨過敏原，會使氣道發(fā)生損傷和重塑[16]。氣道的重塑包括基底膜增厚、上皮下纖維化、血管生成增加和平滑肌細胞增生。其特征是上皮細胞增生，黏液分泌細胞數(shù)量增加，平滑肌肥大，血管生成增加，輔助型T淋巴細胞(T helper cell type 2, Th2)表型改變。這些特征都類似于人類持續(xù)性哮喘的情況。而氣道重塑的發(fā)生可能繼發(fā)于上皮損傷，是上皮修復(fù)障礙的結(jié)果。

2.2 哮喘炎性反應(yīng)與氣道上皮細胞損傷的關(guān)系 哮喘患者的氣道上皮在損傷發(fā)生后，有多種細胞因子釋放，其中包括IL-13、IL-25、IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)等。它們可以激活2型天然淋巴細胞，促進Th2炎性反應(yīng)[17-18]。但上皮細胞在損傷發(fā)生后的細胞因子分泌尚有爭議。

有研究發(fā)現(xiàn)，不同表型和基因型的哮喘患者對吸入或口服皮質(zhì)類固醇等抗炎治療反應(yīng)各異，其中一些患者不伴有氣道嗜酸性粒細胞炎性反應(yīng)，而以嗜中性粒細胞炎性反應(yīng)為主[19]。針對此類患者，用抗IL-5單克隆抗體(美波利珠單抗)或T細胞導(dǎo)向療法(可改善嗜酸性粒細胞炎性反應(yīng))治療后，癥狀控制不佳[20]。值得注意的是，在沒有特應(yīng)性炎性反應(yīng)或嚴重氣道炎性反應(yīng)的情況下，結(jié)構(gòu)改變本身也與哮喘患者呼吸道癥狀和氣道生理功能異常有關(guān)[21]。以上皮損傷和修復(fù)受損為特征的氣道重塑、網(wǎng)狀基底膜增厚、氣道平滑肌和杯狀細胞肥大、增生和血管生成不一定是繼發(fā)于氣道炎性反應(yīng)，而可能與氣道炎性反應(yīng)并行發(fā)生。因此，哮喘患者潛在的上皮功能缺陷可能使其氣道易于發(fā)生損傷、炎性反應(yīng)、氣道重塑及哮喘癥狀的持續(xù)。

2.3 哮喘Th2型炎性反應(yīng)與氣道上皮細胞損傷修復(fù) 哮喘患者氣道上皮細胞較正常人損傷修復(fù)能力差，目前已有多項關(guān)于Th2型炎性反應(yīng)的研究[22]，但對于Th2型炎性反應(yīng)中各種重要的細胞因子對上皮細胞損傷修復(fù)的作用，尚有爭議[23]。人們通過小鼠模型描述了Th1、Th2型炎性反應(yīng)在免疫應(yīng)答中的作用。結(jié)果顯示，在過敏性哮喘模型中，炎性反應(yīng)以Th2型反應(yīng)為主[17]。用皮質(zhì)類固醇及靶向Th2通路組分的分子，如抗IgE、IL-4和IL-13治療，證實了Th2型炎性反應(yīng)與過敏性哮喘之間的關(guān)系[18]。

在Th2型炎性反應(yīng)與上皮細胞損傷修復(fù)關(guān)系的實驗中，IL-13頗受關(guān)注。已知IL-13能上調(diào)與氣道上皮重塑相關(guān)蛋白的表達，其中包括periostin和表面蛋白D[24]。雖然IL-13會參與一系列與哮喘相關(guān)的炎性反應(yīng)，但對上皮細胞屏障功能的作用尚存在矛盾。有學(xué)者認為IL-13對損傷修復(fù)起促進作用，也有實驗顯示IL-13會破壞上皮細胞的屏障功能，并降低細胞損傷修復(fù)能力[23，25]。還有研究認為，IL-13似乎具有雙重作用：低水平的IL-13將有利于BEC遷移和傷口愈合，而高水平IL-13可能降低細胞損傷修復(fù)[26]。

3 哮喘患者氣道上皮細胞損傷修復(fù)的模型研究

許多體外和體內(nèi)模型已被開發(fā)用于研究慢性氣道疾病，拓寬對生理和病理狀態(tài)的理解，以及發(fā)現(xiàn)新的治療藥物。然而，體內(nèi)動物模型往往由于缺乏人體疾病如哮喘的解剖學(xué)或遺傳學(xué)基礎(chǔ)，并有顯著的種間差異，而難以與人類生物學(xué)聯(lián)系起來。例如動物模型缺乏人肺呼吸細支氣管中基底細胞的單純立方體上皮[27]。在小鼠中，含有基底祖細胞的假復(fù)層上皮主要局限于小鼠氣管，而在主支氣管中沒有基底細胞向柱狀上皮的過渡[27]。在人類哮喘的情況下，由于疾病的異質(zhì)性和對疾病發(fā)病機制的有限知識，研究氣道疾病中主要細胞類型的復(fù)雜相互作用十分困難，確定它們在發(fā)病和疾病發(fā)展中的作用頗具挑戰(zhàn)，而目前尚沒有完整的人類患者替代模型。鑒于實驗過程中無法在人體支氣管內(nèi)行任何形式的損傷，為了克服種間差異，明確細胞對損傷的特異性反應(yīng)，上皮細胞培養(yǎng)模型已被廣泛使用。這些培養(yǎng)方式下的損傷修復(fù)模型對損傷修復(fù)過程的理解具有重要影響。

3.1 氣道上皮單層細胞培養(yǎng)損傷修復(fù)模型 目前主要的細胞培養(yǎng)方式是單層細胞培養(yǎng)，即常規(guī)培養(yǎng)皿培養(yǎng)[28]。使用細胞培養(yǎng)單層損傷試驗有諸多優(yōu)點，如這種培養(yǎng)方式相對簡單易行；細胞選擇多樣，既可以選擇細胞系，亦可選擇原代上皮細胞；連續(xù)動態(tài)觀察細胞在損傷修復(fù)不同時段的表現(xiàn)。人們利用這種培養(yǎng)方式獲得了許多氣道上皮損傷修復(fù)的信息。

通過上皮細胞的單層培養(yǎng)損傷修復(fù)模型，人們發(fā)現(xiàn)哮喘上皮細胞存在損傷修復(fù)缺陷，即上皮缺陷假說，上皮的這種缺陷會在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[29]。多項實驗證實，損傷后的上皮細胞中，多種炎性細胞因子、尤其是Th2相關(guān)細胞因子表達異常，說明上皮細胞的損傷會引起一系列哮喘相關(guān)炎性反應(yīng)，而這些炎性反應(yīng)也被認為是哮喘的重要驅(qū)動因素。在這個模型中，人們還發(fā)現(xiàn)，Th2相關(guān)細胞因子會對細胞損傷修復(fù)產(chǎn)生影響。關(guān)于這種影響，學(xué)界還存在許多爭議，用Th2相關(guān)細胞因子在不同濃度和不同時段刺激上皮細胞，會對損傷修復(fù)產(chǎn)生促進、抑制、甚至是濃度依賴的雙重作用。Th1相關(guān)細胞因子對損傷修復(fù)的影響則與Th2相關(guān)細胞因子相反[4]。單層培養(yǎng)損傷修復(fù)模型為研究上皮細胞損傷修復(fù)與哮喘之間的關(guān)系提供了可能，隨著研究的深入，人們對哮喘的發(fā)生發(fā)展有了更進一步的了解，這一問題仍是現(xiàn)今的研究熱點。

另外，通過單層細胞培養(yǎng)，人們發(fā)現(xiàn)上皮細胞的擴散和遷移依賴于纖維連接蛋白及整合素介導(dǎo)的細胞間相互作用。還有研究使用支氣管上皮細胞系(1HAEo-)體外模型發(fā)現(xiàn)，在正常損傷修復(fù)過程中，mRNA的表達在不同時間點受到不同調(diào)節(jié)[23]。但這些研究也顯示，細胞系和原代細胞培養(yǎng)在損傷修復(fù)時間上的差異，1HAEo-細胞系在24 h內(nèi)愈合，而相同條件下，原代細胞培養(yǎng)至少需要48 h才能愈合[30]。

3.2 氣道上皮細胞氣液平面培養(yǎng)損傷修復(fù)模型 單層細胞培養(yǎng)解決了許多關(guān)于哮喘患者氣道上皮細胞損傷修復(fù)的問題，但人體內(nèi)的支氣管上皮細胞時刻暴露在空氣中，與空氣只相隔細胞表面的黏液毯。而單層細胞培養(yǎng)過程中，上皮細胞浸泡于培養(yǎng)基中，與空氣沒有接觸，細胞沒有明顯極性，與體內(nèi)細胞有很大區(qū)別。常規(guī)的培養(yǎng)皿無法做到既提供細胞所需的養(yǎng)分，又保證細胞接觸外界空氣。如果要研究哮喘患者氣道上皮的真實狀態(tài)，就需要開發(fā)更接近人體內(nèi)狀態(tài)的損傷修復(fù)模型。借助腫瘤侵襲研究中常用的transwell小室培養(yǎng)板，人們研發(fā)出了氣液平面(air-liquid interface, ALI) 培養(yǎng)方式[31]。在transwell培養(yǎng)板的下層放置培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)于上層transwell小室的半透膜上，培養(yǎng)基可以通過transwell小室的半透膜達到細胞下部，這樣既保證細胞所需養(yǎng)分，又能使細胞上表面暴露于空氣，細胞自身分泌的黏液分布于細胞與空氣之間，形成類似于人體內(nèi)支氣管上皮細胞上的黏液毯。

通過此模型，人們發(fā)現(xiàn)哮喘患者分化良好的上皮細胞與單層細胞不同。ALI細胞培養(yǎng)模式會在很大程度上模擬人體內(nèi)情況，培養(yǎng)的細胞會處于極化狀態(tài)，多數(shù)實驗通常選擇培養(yǎng)4周左右的時間，細胞的上層會分化出纖毛[10-11，32]。Wenzel實驗室發(fā)現(xiàn)，支氣管上皮細胞培養(yǎng)至第7天即呈現(xiàn)極化狀態(tài)，細胞表面出現(xiàn)纖毛，細胞呈現(xiàn)復(fù)層生長，這也大大縮短了觀察時間，提高了實驗效率[33]。而且研究也發(fā)現(xiàn)，ALI培養(yǎng)狀態(tài)下細胞間連接形成[32]，以此研究細胞間相互作用對損傷修復(fù)的影響。

但ALI培養(yǎng)也有其局限性，在ALI培養(yǎng)狀態(tài)下，除去培養(yǎng)皿底，光線還需穿過小室半透膜、底層培養(yǎng)基才能達到物鏡，即倒置顯微鏡很難觀察到細胞。小室的上部框架使得正置顯微鏡的物鏡也無法貼近細胞。如何更好地利用ALI培養(yǎng)方式觀察細胞損傷修復(fù)過程有待進一步研究。

3.3 氣道上皮損傷修復(fù)研究的其他模型 技術(shù)的進步和跨學(xué)科研究帶來了更多創(chuàng)新的模型開發(fā)。鼻息肉組織原代上皮二維培養(yǎng)被用于氣道創(chuàng)傷修復(fù)的細胞力學(xué)研究，人們還開發(fā)出原位支氣管黏膜組織的機械損傷模型和三維體外/硅創(chuàng)傷修復(fù)模型[34-35]。其中肺泡上皮創(chuàng)傷修復(fù)的硅膠模型可以模擬細胞培養(yǎng)的損傷修復(fù)模式[36]。另外，體外上皮損傷修復(fù)的數(shù)學(xué)模型也為創(chuàng)傷修復(fù)和細胞生物學(xué)領(lǐng)域提供了新的機會和工具。

4 小 結(jié)

綜上，有效的氣道上皮損傷修復(fù)對維持氣道環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細胞損傷修復(fù)過程的不同是在健康氣道上皮和哮喘氣道上皮的重要差別。各種創(chuàng)新的模型正在更加深入地研究氣道上皮損傷修復(fù)與哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為哮喘的治療尋找新的靶點。