DNA甲基化在癲癇演變和進(jìn)展中的作用

汪智華綜述 林志國(guó)審校

癲癇是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性和刻板性的特點(diǎn)。癲癇的發(fā)病機(jī)制至今不明，對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的研究可以提高對(duì)癲癇的認(rèn)識(shí)，并更好地指導(dǎo)臨床診斷和治療。表觀遺傳機(jī)制是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式，其中DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾。本文就近年來(lái)DNA甲基化在癲癇演變和進(jìn)展中的作用進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（cytosinephosphate-guanine，CpG）二核苷酸的胞嘧啶5'碳位由共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。DNA甲基化通過(guò)DNMT實(shí)現(xiàn)。DNMT包括在發(fā)育早期階段負(fù)責(zé)基因重新甲基化的DNMT-3a、DNMT-3b，以及維持既定甲基化模式的DNMT-1[1]。DNA甲基化位點(diǎn)通常集中在基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，但也可以在基因的其他位點(diǎn)，可以根據(jù)位點(diǎn)和募集的因子促進(jìn)或抑制基因表達(dá)[2]。DNA甲基化改變了DNA的表觀和結(jié)構(gòu)，可直接阻礙DNA的識(shí)別及與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，或者吸引其他因子優(yōu)先與DNA結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而使基因的轉(zhuǎn)錄抑制或沉默。DNA甲基化是動(dòng)態(tài)的，可通過(guò)某些酶的作用對(duì)DNA殘基中甲基進(jìn)行修飾或去除[3]。DNA甲基化的可逆性為使用去甲基化制劑治療人類疾病提供了理論基礎(chǔ)。

2 DNA甲基化與癲癇

近年的研究為異常DNA甲基化和癲癇之間的關(guān)系提供了一些證據(jù)。Belhedi等[4]研究表明在局灶性癲癇和熱性驚厥（febrile seizures，F(xiàn)S）中CPA6啟動(dòng)子甲基化增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)1 d后，近300個(gè)基因出現(xiàn)低甲基化[5]。Li等[6]使用熒光素酶測(cè)定和CpG甲基化，發(fā)現(xiàn)丙戊酸（valproic acid，VPA）可通過(guò)誘導(dǎo)鈉通道Scn3a基因啟動(dòng)子-39C位點(diǎn)甲基化，降低啟動(dòng)子活性，產(chǎn)生抗癲癇作用，表明CpG甲基化在癲癇中的重要作用。更有研究表明，DNA甲基化失調(diào)是癲癇的原因，而不是癲癇的結(jié)果[7]。

3 與癲癇相關(guān)常見(jiàn)的基因甲基化

3.1 RASgrf1基因甲基化與癲癇RASgrf1，即Ras-鳥(niǎo)嘌呤核苷酸釋放因子1，是一種父系印記基因，其啟動(dòng)子具有差異甲基化區(qū)域，可以使基因表達(dá)沉默。Chen等[8]使用紅藻氨酸（kainate，KA）致癇小鼠的動(dòng)物模型研究RASgrf1啟動(dòng)子甲基化水平隨癲癇進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)RASgrf1啟動(dòng)子甲基化在急性發(fā)作期后逐漸增加，并在潛伏期達(dá)到最大值，隨后抑制RASgrf1 mRNA和蛋白表達(dá)，在慢性期達(dá)到最低水平。RG108，一種DNMT抑制劑，可抑制RASgrf1基因甲基化的增加，使RASgrf1基因甲基化在潛伏期被顯著抑制，并在慢性期恢復(fù)正常表達(dá)水平。RG108可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，抑制KA致癇小鼠的急性癲癇發(fā)作，而且心室注射RG108干擾潛伏期，可觀察到慢性期自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作小鼠數(shù)量顯著減少，表明RG108可以改變癲癇的進(jìn)展并防止KA誘導(dǎo)的癲癇小鼠發(fā)展成慢性癲癇[9]。這提示對(duì)RASgrf1基因甲基化的進(jìn)一步研究有望闡明癲癇急性發(fā)作，急性期向慢性期轉(zhuǎn)變或癲癇復(fù)發(fā)性特點(diǎn)的機(jī)制，并有望發(fā)現(xiàn)新的基因治療靶點(diǎn)，終止癲癇急性發(fā)作及其復(fù)發(fā)。

3.2 青少年肌陣攣性癲癇（juvenile myoclonic epilepsy，JME）相關(guān)基因甲基化JME是以肌陣攣、全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作、失神發(fā)作為特征的遺傳性全身性癲癇綜合征，占所有癲癇的5%～10%，占特發(fā)性全身性癲癇的18%[10]。最近，Santos等[11]借助PRISMA指南對(duì)JME遺傳關(guān)聯(lián)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，認(rèn)為編碼含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2（bromodomain-containing protein 2，BRD2）的基因是JME一種重要的致病基因。隨后，Pathak等[12]研究表明BRD2基因啟動(dòng)子甲基化與高加索人的JME有關(guān)。Schulz等[13]基于相同的JME診斷標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)對(duì)象招募計(jì)劃，卻得出完全相反的結(jié)論，認(rèn)為目前的研究結(jié)果不支持先前研究中強(qiáng)調(diào)的BRD2基因是JME的致病基因。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，使膜電位超極化，降低神經(jīng)元的興奮性，有助于維持正常腦功能并防止癲癇發(fā)作。研究指出，GABA能系統(tǒng)在介導(dǎo)神經(jīng)元可塑性以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮重要作用[14]。由GABA-A型 受 體（GABA A receptor,GABAAR）活化介導(dǎo)的突觸后抑制，通過(guò)陽(yáng)離子-氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（cation-Cl-cotransporter，CCC）實(shí)現(xiàn)，包括鈉-鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（NA--K--Clcotransporter 1，NKCC1）和鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（K--Cl-cotransporter 2，KCC2），通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度，維持神經(jīng)元Cl-穩(wěn)態(tài)，調(diào)控神經(jīng)元功能[15]。最新的研究[16]通過(guò)比較JME與健康對(duì)照組的DNA甲基化狀態(tài)，研究NKCC1和KCC2在JME中的潛在作用，結(jié)果顯示JME病人NKCC1基因甲基化水平顯著降低，而KCC2基因甲基化水平顯著升高。這提示JME病人NKCC1呈高表達(dá)，KCC2則呈低表達(dá)。由于NKCC1和KCC2表達(dá)失調(diào)引起的神經(jīng)元內(nèi)外Cl-濃度差，可能弱化GABAAR介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性抑制作用，到一定程度后，又可能引起神經(jīng)元過(guò)度興奮，即從超極化效應(yīng)向去極化效應(yīng)的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。

3.3 RELN基因甲基化與癲癇RELN基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂區(qū)域，蛋白產(chǎn)物Reelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Reelin是由Cajal-Retzius細(xì)胞合成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在哺乳動(dòng)物大腦的早期發(fā)育中，可作為神經(jīng)細(xì)胞遷移終止信號(hào)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的遷移和定位，誘導(dǎo)大腦層狀結(jié)構(gòu)形成。而在成熟的腦組織中，Reelin蛋白可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的功能，以及參與大腦層狀結(jié)構(gòu)的維持。記憶主要存儲(chǔ)在大腦皮層，并與海馬結(jié)構(gòu)及腦內(nèi)化學(xué)成分的變化有關(guān)。FS是幼兒癲癇發(fā)作的最常見(jiàn)類型。Dai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，RELN基因的高甲基化與FS記憶缺陷有關(guān)，并且這種記憶缺陷具有以下特點(diǎn)：①可跨代遺傳，幼鼠長(zhǎng)時(shí)間FS發(fā)作可導(dǎo)致成年后記憶缺陷，這種記憶缺陷可由曾在幼年時(shí)期經(jīng)歷過(guò)長(zhǎng)時(shí)間FS的母鼠通過(guò)基因傳遞給子代；②可逆轉(zhuǎn)性，DNMT活性是這種記憶缺陷所必需的，DNA甲基化有助于FS誘導(dǎo)的記憶缺陷的跨代傳遞，DNMT抑制劑可抑制DNMT-1的高表達(dá)和RELN基因的高甲基化，并逆轉(zhuǎn)跨代記憶缺陷；③可挽救性，早期豐富環(huán)境治療可以挽救年幼時(shí)FS引起的成年期記憶缺陷，由于DNMT抑制劑對(duì)嬰幼兒有不可預(yù)測(cè)的副作用，此時(shí)環(huán)境治療更能體現(xiàn)出其安全性和有效性。

3.4 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因甲基化與癲癇BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有著廣泛的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。BDNF能促進(jìn)苔蘚纖維出芽，建立新的突觸連接，其高表達(dá)能導(dǎo)致癲癇發(fā)作[18]。顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人和青少年最常見(jiàn)的難治性癲癇，通常伴有不同程度的記憶障礙，潛在分子機(jī)制尚不清楚。研究指出，海馬注射BDNF可增加癲癇發(fā)作[19]，在記憶形成期間，海馬BDNF基因轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化機(jī)制調(diào)控[20]，并且BDNF甲基化在癲癇模型海馬中受到異常調(diào)節(jié)[21]。這提示BDNF過(guò)表達(dá)可能通過(guò)增加皮質(zhì)活動(dòng)和癲癇易感性而導(dǎo)致記憶缺陷。近期的研究還指出發(fā)作間期棘波活動(dòng)和θ頻率振蕩是導(dǎo)致癲癇記憶障礙的原因[22]。Parrish等[23]使用KA誘導(dǎo)的TLE小鼠，通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法，證實(shí)在記憶鞏固期BDNF基因甲基化水平降低與癲癇海馬異常高水平的BDNF mRNA強(qiáng)烈相關(guān)；用甲硫氨酸（Met）補(bǔ)充甲基，可增加BDNF基因甲基化，在記憶鞏固過(guò)程中降低海馬BDNF mRNA的水平；同時(shí)，腦電圖顯示，發(fā)作間期棘波活動(dòng)減少，θ節(jié)律能力增加。這表明異常DNA甲基化介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄與TLE相關(guān)的記憶缺陷密切相關(guān)，通過(guò)Met補(bǔ)充甲基可能逆轉(zhuǎn)海馬依賴性記憶缺陷。但是Met以何種更安全有效的方式補(bǔ)充以及量的確定仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，癲癇演變和進(jìn)展的一個(gè)主要假設(shè)是基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)的大規(guī)模變化導(dǎo)致異常的網(wǎng)絡(luò)重組和過(guò)度興奮，導(dǎo)致癲癇發(fā)作反復(fù)發(fā)生。DNA甲基化引起的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)的異常改變，可能在癲癇異常網(wǎng)絡(luò)形成或重組中起作用，癲癇相關(guān)基因甲基化的研究作為一個(gè)新的領(lǐng)域具有廣泛前景，有助于了解癲癇機(jī)制，并根據(jù)特定基因位點(diǎn)的甲基化改變定制特定的甲基化調(diào)節(jié)劑，以抑制或增強(qiáng)癲癇相關(guān)基因的甲基化，從而更好地治療癲癇，使手術(shù)作為一個(gè)補(bǔ)充應(yīng)用于極少數(shù)藥物難治性癲癇。