腰椎椎間盤退行性變動物模型建立方法的研究進(jìn)展

姚明鶴，陳家磊

1.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610041 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，成都 610041

腰痛是目前全球首位致殘疾病，給患者、家庭和社會造成極大的痛苦和沉重的負(fù)擔(dān)。與增齡有關(guān)的椎間盤退行性變（IDD）是腰痛的最主要原因。隨著工作與生活節(jié)奏的加快，IDD呈現(xiàn)年輕化的趨勢。建立符合IDD規(guī)律、成功率高、可重復(fù)性好、操作簡單、成本低且適合醫(yī)學(xué)研究的IDD動物模型，對明確腰椎IDD的發(fā)生機(jī)制及開展防治工作具有一定意義。目前的腰椎IDD動物模型大致可分為自發(fā)模型、損傷模型和生物力學(xué)模型等，本文依據(jù)以上分類作如下綜述。

1 自發(fā)模型

自發(fā)模型包括自然自發(fā)和誘導(dǎo)自發(fā)。自然自發(fā)模型是指不經(jīng)特殊處理，實驗動物在成長發(fā)育過程中自然發(fā)生與人類相似的IDD，這種模型可避免人為操作因素的干擾，但只有沙鼠、恒河猴、犬及狒狒等少數(shù)動物可滿足條件。學(xué)者們在研究模型制備方法的同時也在不斷擴(kuò)大實驗動物的選擇范圍，并發(fā)現(xiàn)豚鼠椎間盤的形態(tài)學(xué)及隨年齡增加其髓核內(nèi)蛋白多糖減少的規(guī)律與人類相似，將其作為動物模型可較客觀地模擬自然自發(fā)IDD過程［1］。常用于基因相關(guān)研究的SM/J小鼠，可較早表現(xiàn)出典型的IDD特征［2］。但這些特殊動物之間性狀差異明顯，退行性變程度不可控，用于治療研究可信度差，多用于IDD發(fā)生機(jī)制的研究。從而誘導(dǎo)自發(fā)模型是通過基因技術(shù)敲除實驗動物的特定基因，造成椎間盤特定成分合成、代謝異常，誘導(dǎo)IDD發(fā)生。Chsy3基因敲除小鼠模型誘發(fā)的IDD進(jìn)程相對較緩，應(yīng)用于IDD的研究更有優(yōu)勢［3］。基因敲除模型證明了基因、遺傳因素對IDD的影響，適用于發(fā)生機(jī)制、藥物作用靶點基因?qū)哟蔚难芯?，但模型均只涉及某一特定基因，造成的影響很局限；另外，其實驗條件要求高、操作復(fù)雜、成本高，不適宜作為工具模型大量使用。另有藥物誘導(dǎo)自發(fā)模型，通過向?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)注射D-半乳糖，造成代謝異常，引起各器官受損、系統(tǒng)功能衰退等變化，使椎間盤的結(jié)構(gòu)、生理狀況發(fā)生變化，促成椎間盤衰老［4］。

2 損傷模型

2.1 髓核損傷

損傷髓核方式大體上可分為物理損傷和化學(xué)損傷。物理損傷主要是通過髓核摘除或髓核穿刺并抽吸/旋切的方法建立模型。Shi等［5］在顯微鏡下使用微型手術(shù)刀摘除小鼠椎間盤髓核成功建立模型。用較粗的針頭穿刺兔纖維環(huán)并抽取髓核［6-7］、施加負(fù)壓［8］或用針尖旋切髓核組織［9］等方式均可成功建立模型。為保持纖維環(huán)完整性，可經(jīng)椎弓根切除部分髓核來建立IDD模型［10］，但有學(xué)者認(rèn)為，此類模型為IDD導(dǎo)致脊柱不穩(wěn)，而非脊柱不穩(wěn)造成IDD［11］。

化學(xué)損傷是將木瓜凝乳蛋白酶、軟骨素酶ABC、纖連蛋白片段（Fn-f）等化學(xué)物質(zhì)注入椎間盤內(nèi)［12-14］，引起髓核細(xì)胞變性、消融，導(dǎo)致IDD。實驗研究［12］表明，兔腰椎IDD程度隨木瓜凝乳蛋白酶注射量增加而加重。將軟骨素酶ABC注入大鼠Co7/Co8椎間盤，可以成功建立模型［13］。將軟骨酶ABC注入山羊椎間盤可引起IDD，且退行性變程度隨注射劑量增加而加重［15］。將Fn-f注入兔腰椎椎間盤中心，組織學(xué)證據(jù)顯示，8周時椎間盤開始發(fā)生退行性變，分別于8、12周時，聚集蛋白聚糖mRNA、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)程度低于對照組［14］。但化學(xué)損傷，其注入量控制困難，建模效果不穩(wěn)定，且穿刺部位易形成骨贅，化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致椎間盤組織代謝異常，對藥物的作用效果及后期檢驗指標(biāo)造成干擾，可靠性欠佳。有學(xué)者用0.9%氯化鈉溶液注入兔腰椎椎間盤，以避免化學(xué)物質(zhì)干擾，也成功建立了模型［16］。

2.2 終板損傷

終板是椎間盤營養(yǎng)代謝的通道，同時也是隔絕自身免疫系統(tǒng)攻擊的屏障，終板受損會導(dǎo)致椎間盤組織的營養(yǎng)供給阻斷，并暴露于免疫系統(tǒng)之下。引發(fā)終板損傷的方法主要包括終板穿刺、藥物注射和營養(yǎng)阻斷等。與切開纖維環(huán)、腰椎動靜力失穩(wěn)模型相比，終板穿刺方法造成的退行性變更為平緩。對恒河猴L(fēng)5/L6椎間盤上、下終板分別注入2 mg平陽霉素可成功建立模型［17］。Yin等［18］在羊腰椎距上、下終板2 mm處開一道2～3 mm細(xì)縫，并填充骨水泥阻斷終板營養(yǎng)，48周時觀察到髓核細(xì)胞成分進(jìn)行性丟失，軟骨終板進(jìn)行性鈣化，封閉的椎間盤內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白增加、Ⅱ型膠原蛋白減少，證明阻斷營養(yǎng)途徑可以誘導(dǎo)IDD。Fernández-Susavila等［19］采用終板下鉆孔后橫向擺動鉆頭的方式完全破壞終板血液供應(yīng)，成功建立SD大鼠IDD模型。但Hutton等［20］對破壞終板結(jié)構(gòu)建立的IDD模型的可信度提出質(zhì)疑，并使用骨水泥將犬腰椎椎間盤上終板或同位椎間盤上、下終板進(jìn)行封閉，在70周的觀察中并未發(fā)現(xiàn)任何明顯的IDD現(xiàn)象。

2.3 纖維環(huán)損傷

手術(shù)切開纖維環(huán)是最早的纖維環(huán)損傷模型建模方法，造成IDD效果顯著，但對纖維環(huán)破壞太大，易引起髓核脫出，很快便被纖維環(huán)穿刺法取代，其中經(jīng)腹膜外穿刺最為常用。用18G針頭對L4/L5和L5/L6椎間盤進(jìn)行穿刺，可成功建立兔腰椎IDD模型［21］。結(jié)合低溫等離子消融技術(shù)誘導(dǎo)的IDD過程較單純穿刺更為緩慢［22］。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，可在透視引導(dǎo)下經(jīng)皮完成纖維環(huán)穿刺術(shù)，所建立的兔、犬腰椎IDD模型均有充分影像學(xué)及組織學(xué)證據(jù)，此方法減少了對實驗動物的損傷、降低了感染率，但對操作者技術(shù)要求更高［23-24］。與其他損傷模型相比，纖維環(huán)穿刺模型不僅造模周期短（2周即可出現(xiàn)IDD現(xiàn)象，腰椎失穩(wěn)法則需4周［25］），且損傷程度小，效果確切，可控性好，成功率高，是目前最為常用的模型之一。但其機(jī)制本質(zhì)是急性損傷造成IDD，客觀來說未能準(zhǔn)確模擬人類IDD的發(fā)生機(jī)制，造成的IDD過于嚴(yán)重且不可逆，可能會影響對于藥物等防治手段治療腰椎IDD的機(jī)制研究。

3 生物力學(xué)模型

3.1 異常應(yīng)力

異常應(yīng)力模型是通過機(jī)械裝置向椎間盤施加負(fù)荷。鼠的尾椎定位便捷，這使其成為這類實驗首選動物。1952年，Lindblom［26］將鼠尾“U”形固定一段時間后觀測到鼠尾凹側(cè)發(fā)生IDD，后來學(xué)者們根據(jù)這一研究不斷優(yōu)化彎曲應(yīng)力模型［27］，并利用軸向負(fù)荷造模。1999年，Iatridis等［28］設(shè)計了Ilizarov-type加壓裝置，這是研究軸向壓縮應(yīng)力對椎間盤影響的經(jīng)典靜態(tài)模式。與針刺損傷法相比，靜態(tài)加壓法造成的IDD病理分級更高［29］。隨著軸向加壓裝置的精簡化，軸向應(yīng)力模型實現(xiàn)了對加壓大小、頻次及動態(tài)加壓的精準(zhǔn)控制［30-32］。但由于鼠尾椎結(jié)構(gòu)細(xì)小，置入裝置不便，學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)向體積更大的山羊腰椎，效果也十分理想［33］。軸向加壓裝置的反向應(yīng)用則證實了過度的張力負(fù)荷也可誘導(dǎo)IDD［34］。由于人類獨特的直立運動方式，使人類脊柱呈現(xiàn)獨特的生理彎曲，這意味著人類的椎間盤承載更多的剪切應(yīng)力。有研究［35］表明，剪切應(yīng)力確實會對椎間盤造成損傷，應(yīng)用剪切力加載裝置可成功構(gòu)建剪切應(yīng)力模型。

此類模型選材不受限制，可操作性好，造模周期短，效果穩(wěn)定。但目前的異常應(yīng)力模型多研究彎曲、軸向加壓、剪切等單一應(yīng)力對椎間盤的影響，與人體椎間盤日常生理和病理應(yīng)力情況相比，無論是受力方式還是作用部位，都有明顯的區(qū)別。同時，鼠尾椎椎間盤與人腰椎椎間盤解剖結(jié)構(gòu)、體積大小相差甚遠(yuǎn)，不適于進(jìn)行相關(guān)生物治療研究。在置入裝置的過程中易出現(xiàn)局部感染、椎體骨折、脊髓損傷甚至死亡等情況［36］，這些均阻礙其成為理想的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

3.2 直立

對于雙后肢直立大鼠模型，目前采用的是出生2 d～1個月的幼鼠，造模方法為截去大鼠前肢，強(qiáng)迫大鼠模擬人類直立行走。Cassidy等［37］設(shè)計的雙后肢直立大鼠模型，結(jié)扎出生僅18～36 h的Wistar大鼠的雙前肢，將飼料和水維持在剛剛可得到的位置，并隨大鼠的成長逐漸升高位置，迫使大鼠使用雙后肢站立。截去2月齡SD大鼠雙前肢并采用該特殊方法飼養(yǎng)，處死動物后取L5/L6椎間盤檢查，可見IDD明顯，纖維環(huán)排列紊亂，髓核皺縮，終板不連續(xù)，椎體邊緣可見明顯增生，椎間隙高度變?。?8］。

雙后肢直立模型的造模時間跨度較大（6～18個月）；實驗動物的存活率不等（11.2%～21.0%）；選用大鼠的月齡也有差別。有學(xué)者對這種模型建立方法提出質(zhì)疑，Bailey等［39］在對雙后肢大鼠和正常大鼠（四足鼠）進(jìn)行的24 h連續(xù)對比觀察中發(fā)現(xiàn)，雙足大鼠直立活動時間并未較正常大鼠增加，并沒有建立真正意義上的“直立”模型。同時，這種模型建立方法在倫理上也存在爭議。實驗動物的選材也存在一定局限性，因較大型動物維持雙后肢站立行走難度較大，目前僅使用大鼠來建立直立模型。

強(qiáng)迫直立模型多選用兔進(jìn)行造模，將新西蘭大白兔固定于直立管道中4～12周，可成功誘導(dǎo)IDD發(fā)生。造模過程中，椎間盤內(nèi)纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)逐漸紊亂，髓核中蛋白多糖減少，造成椎間盤高度降低，且組織學(xué)改變先于影像學(xué)改變［40］。強(qiáng)迫兔直立的同時，在兔頸部額外增加600 g負(fù)重可加快IDD發(fā)生，14周可成功建立腰椎IDD模型。但作者同時指出，雖然負(fù)重項圈進(jìn)一步增加腰椎軸向應(yīng)力，加速IDD進(jìn)程，但實驗動物的頸部項圈負(fù)重不宜超過其體質(zhì)量的1/4，每日加載時間不宜超過6 h，否則動物可能發(fā)生易怒、食欲減退、腹瀉等不良反應(yīng)［41］。

直立模型歷史悠久，操作簡單，其最大的優(yōu)勢在于改變了實驗動物脊柱的生物力學(xué)分布，使其具有與人類腰椎IDD相似的應(yīng)力環(huán)境，借助增加的異常應(yīng)力來加速IDD的發(fā)生。

3.3 腰椎失穩(wěn)

人類脊柱主要依靠椎體、關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、附著于其上的肌肉及韌帶等組織維持穩(wěn)定，脊柱在勞損、外傷和醫(yī)源性損傷時失去穩(wěn)定，即可發(fā)生IDD。學(xué)者們依據(jù)這一理論建立失穩(wěn)模型，包括了靜力失穩(wěn)、動力失穩(wěn)和動靜力失穩(wěn)模型，模擬人類腰椎IDD的病理改變。靜力失穩(wěn)模型一般是通過切除腰椎棘上韌帶、棘間韌帶和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的方式，破壞脊柱靜力平衡來建模；放射學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果顯示靜力失穩(wěn)模型與人類IDD相似［42］。動力失穩(wěn)是通過多節(jié)段剝離骶棘肌和關(guān)節(jié)突附著肌肉或切斷豎脊肌直接破壞椎旁肌動力平衡。動靜力失穩(wěn)模型是將以上2種結(jié)構(gòu)全部切除或切斷來實現(xiàn)。在建立動靜力失穩(wěn)家兔模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合額外負(fù)重法（在家兔背部壓重達(dá)體質(zhì)量1/10的物體），可以加速建模過程［43］。腰椎失穩(wěn)模型可用于模擬姿勢、環(huán)境因素導(dǎo)致的IDD。

3.4 腰椎融合

腰椎融合模型是通過椎體融合或椎間關(guān)節(jié)融合的方式，誘發(fā)相鄰椎間盤發(fā)生退行性變，達(dá)到模擬脊柱融合術(shù)后IDD的目的。此類造模方式需要一定體積的椎體，多選兔作為實驗動物。Higashino等［44］對兔L3～5橫突關(guān)節(jié)進(jìn)行固定，影像學(xué)檢查結(jié)果表明，術(shù)后1年椎間盤發(fā)生明顯退行性變，而且固定椎體相鄰的頭側(cè)IDD更加嚴(yán)重。腰椎融合模型主要用于脊柱融合術(shù)后鄰椎病發(fā)生機(jī)制的研究。

4 其他模型

石芳芳等［45］通過結(jié)扎兔L4，5左側(cè)節(jié)段血管，造成L4/L5椎間盤雙側(cè)缺血，L3/L4椎間盤單側(cè)缺血，成功建立兔腰椎IDD模型，影像學(xué)表明IDD程度與缺血程度成正比。楊屆等［46］的實驗表明，大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)后8周，椎間盤開始出現(xiàn)明顯退行性變，12周時退行性變更加嚴(yán)重。

5 結(jié)語與展望

動物模型能否適用于腰椎IDD發(fā)生機(jī)制或相關(guān)治療研究，主要視動物模型與人類腰椎IDD相關(guān)性和相似度大小而定。IDD模型的制備已有近80年的歷史，應(yīng)用的實驗動物包括大鼠、小鼠、沙鼠、兔、犬、豬、羊和靈長類動物等。因?qū)嶒瀯游锛怪c人類在生長發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)和生物化學(xué)等方面的差異，及隨著年齡增長IDD發(fā)生率的變化不同，至今尚無公認(rèn)的理想動物模型。靈長類動物與人類親緣關(guān)系最近，是最理想的模型動物，但來源稀少、飼養(yǎng)困難，并涉及倫理等問題，不適宜廣泛應(yīng)用；綿羊脊柱及椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)與人類差異較大，力學(xué)性能也有所不同［47］；犬類IDD的髓核脊索細(xì)胞被軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞替代，這點與人類相似，但犬的腰椎椎間盤數(shù)量比人類多2個，且軟骨終板比人類厚［48］；大、小鼠和家兔等小型四足動物椎間盤的內(nèi)部壓力可能與人類相近，且考慮到實驗成本等，大、小鼠和家兔仍然是大多數(shù)學(xué)者的選擇［49］。

學(xué)者們通過模擬人類直立、勞損、損傷、醫(yī)源性損傷等導(dǎo)致IDD的常見因素，成功建立動物腰椎IDD模型。但動物種屬及椎間盤解剖形態(tài)、生化特性等與人類椎間盤不同，目前的IDD模型只能盡量模擬人類IDD，仍需彌補(bǔ)各自不足。自發(fā)模型較為符合IDD發(fā)生過程，但重復(fù)性較差，退行性變程度不可控。椎間盤損傷模型可控性好，效果確切，但與客觀IDD發(fā)生過程的符合程度有限。不同于四足動物，人類脊柱的長期直立狀態(tài)和腰椎生理曲度的存在，使L4/L5和L5/S1椎間盤處于剪切應(yīng)力之下，成為IDD發(fā)生的主要原因。因此，模擬人類腰椎IDD真實力學(xué)環(huán)境的直立模型是研究腰椎IDD的可靠模型。但如何快速、有效構(gòu)建生物力學(xué)模型仍需進(jìn)一步研究。目前對IDD機(jī)制的闡釋還不是非常理想，如何模擬人體脊柱復(fù)雜的生理狀態(tài)和病理改變，構(gòu)建出更加符合人類腰椎IDD過程的動物模型仍是今后工作的重點。