糖酵解關(guān)鍵酶在宮頸癌Warburg效應(yīng)中的作用研究進(jìn)展

范佳楊，梁 婷綜述，劉 康，羅岳西審校

0 引 言

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率僅次于乳腺癌，死亡率位居全球第二[1]。全世界每年大約有50萬(wàn)名婦女被診斷出宮頸癌，且發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。Warburg效應(yīng)作為腫瘤細(xì)胞代謝特征之一，發(fā)現(xiàn)至今已近百年，在近10余年被廣泛研究，被大量研究深入探討。目前關(guān)于腫瘤細(xì)胞中普遍存在Warburg效應(yīng)的解釋有多種，其中一個(gè)熱點(diǎn)集中在糖酵解通路中的一些關(guān)鍵酶上，如烯醇化酶(Enolase)、磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)、己糖激酶(Hexokinase, HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等。研究表明，在腫瘤組織和細(xì)胞中，這些關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性發(fā)生了改變[2-5]。因此，許多參與糖酵解的關(guān)鍵酶有望成為宮頸癌治療的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新思路。本文主要就與宮頸癌Warburg效應(yīng)相關(guān)的酶作一綜述。

1 Warburg效應(yīng)

葡萄糖是一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，糖代謝對(duì)于維持動(dòng)物的生命活動(dòng)至關(guān)重要。細(xì)胞的能量主要來(lái)源于糖代謝，糖代謝有兩種途徑，氧化磷酸化和糖酵解。正常細(xì)胞在有氧條件下糖酵解被抑制，主要利用的是有氧呼吸。20世紀(jì)20年代，德國(guó)生物化學(xué)家Otto Heineieh Warburg研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的糖代謝存在很大的不同，在惡性增殖過(guò)程中，能量代謝途徑發(fā)生了改變，癌變細(xì)胞的能量代謝途徑由三羧酸循環(huán)為主轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鉃橹?。Warburg指出在氧氣供應(yīng)充足的情況下，腫瘤細(xì)胞仍然偏好以糖酵解來(lái)獲取能量，而不是供能效率更高的氧化磷酸化，這一現(xiàn)象被稱(chēng)之為Warburg效應(yīng)[6]。Warburg效應(yīng)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)增殖分化的能量需要所發(fā)生的代謝重構(gòu)，該效應(yīng)為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖提供大量的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，并且制造了適宜腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境，增強(qiáng)了其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，也幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫和細(xì)胞凋亡機(jī)制。

據(jù)報(bào)道，糖酵解酶轉(zhuǎn)錄的上調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7-9]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，許多糖酵解基因Warburg效應(yīng)聯(lián)系在一起，為糖代謝在腫瘤發(fā)生中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)[10]。因此通過(guò)利用糖酵解過(guò)程的代謝特點(diǎn)，篩選出一些糖酵解相關(guān)的酶，特異地抑制腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，將有效地抑制腫瘤的侵襲和增殖，為腫瘤的治療提供新的途徑。

2 與Warburg效應(yīng)相關(guān)的酶

2.1 EnolaseEnolase是一種金屬酶[11]，是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，有三種不同形式的烯醇化酶，即ENO1、ENO2和ENO3[12]。ENO1在許多腫瘤中的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)量均上調(diào)[3]。ENO1在細(xì)胞的分布位置和表現(xiàn)的功能不同，在腫瘤細(xì)胞表面可以觀察到ENO1，如乳腺癌、肺癌和胰腺癌細(xì)胞[13-15]。在細(xì)胞表面，ENO1與纖溶酶原結(jié)合，纖溶酶原和纖溶酶的細(xì)胞外蛋白水解活性在癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。在細(xì)胞核表達(dá)的ENO1與MYC結(jié)合(MYC為編碼基本核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因和原癌基因家族，屬于堿性螺旋環(huán)螺旋DNA結(jié)合蛋白超家族，主要調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、細(xì)胞周期、代謝、存活、凋亡以及腫瘤發(fā)生[16]，抑制環(huán)氧合酶COX2的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)化[17]，但 ENO1 對(duì)腫瘤細(xì)胞促進(jìn)增殖的作用并未在正常細(xì)胞中觀察到[18]。烯醇化酶能夠催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸[19]。張棟棟等[20]通過(guò)western blot法驗(yàn)證了通過(guò)慢病毒建立的沉默ENO1基因的細(xì)胞的ENO1表達(dá)量明顯低于正常細(xì)胞。采用MTT法檢測(cè)出沉默ENO1基因后的宮頸癌Siha細(xì)胞增殖能力減弱，并且對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)。Michela 等[12]通過(guò)研究胰腺癌及乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可通過(guò)沉默ENO1來(lái)抑制糖酵解和促進(jìn)氧化磷酸化這兩方面來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)。沉默ENO1后，細(xì)胞中的磷酸果糖激酶表達(dá)下調(diào)，這將嚴(yán)重影響葡萄糖進(jìn)入糖酵解過(guò)程。由于糖酵解通量受損，沉默ENO1后乳酸水平下降。沉默ENO1后的細(xì)胞還表現(xiàn)出谷氨酰胺酶的活性增加，谷氨酰胺代謝物在三羧酸循環(huán)中被迅速消耗，所有細(xì)胞系均觀察到線粒體鏈電子通量的上調(diào)，特別是通過(guò)復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ，同時(shí)增加了耗氧量，ATP的合成量也有了很大程度的增加。ENO1沉默的細(xì)胞傾向于消耗更多的O2維持氧化磷酸化[7]。由此可見(jiàn)，ENO1在腫瘤細(xì)胞中普遍呈高表達(dá)，ENO1將會(huì)是宮頸癌治療中一個(gè)非常有前景的和臨床相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.2 PGAMPGAM是最初在腦組織中發(fā)現(xiàn)的PGAM家族成員，包含PGAM1和PGAM2兩個(gè)同源二聚體[21]。定位于人染色體10q25.3區(qū)域，編碼cDNA全長(zhǎng)1709 bp，包括一個(gè)31-bp 5′非翻譯區(qū)(5′UTR)、一個(gè)765 bp編碼區(qū)和一個(gè)913-bp 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，延伸至Polya尾。既往有研究已證實(shí)PGAM1是參與細(xì)胞有氧糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，PGAM 1通過(guò)協(xié)調(diào)糖酵解戊糖磷酸途徑來(lái)支持癌細(xì)胞快速增殖，這與其控制細(xì)胞內(nèi)3-磷酸甘油和2-磷酸甘油的代謝功能有關(guān)[4]。傅柳桃等[2]采用免疫組化法檢測(cè)了67例宮頸癌和癌旁組織中PGAM1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示宮頸癌組織中PGAM1表達(dá)明顯高于癌旁組織。同時(shí)運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量實(shí)時(shí)PCR和Western blot法，檢測(cè)宮頸癌Hela細(xì)胞的周期、凋亡以及增殖情況，初步證實(shí)了PGAM1是通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)、調(diào)控 Warburg效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。MTT結(jié)果表明，宮頸癌Hela細(xì)胞PGAMl基因沉默后，腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著增加，葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量明顯降低，PTEN表達(dá)量明顯上調(diào)，PTEN是Akt/mTOR信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控蛋白，具有抑制癌基因的活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促使腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。由此可見(jiàn)，PGAM1在宮頸癌組織中表現(xiàn)為上調(diào)，且可作為宮頸癌診治的標(biāo)志物。

2.3 HKHK是葡萄糖代謝過(guò)程中的第一個(gè)限速酶，催化葡萄糖生成6-磷酸-葡萄糖(G-6-P)，作為ATP生產(chǎn)和代謝物生物合成的底物[22-23]。HK有四種亞型：HK-Ⅰ，HK-Ⅱ，HK-Ⅲ，HK-Ⅳ。HK1主要與線粒體結(jié)合，主要參與ATP生成的分解代謝，而HK2主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要參與代謝物的合成[24-25]。在免疫組織化學(xué)分析中，正常宮頸組織幾乎無(wú)HK2信號(hào)，而約60%的宮頸癌標(biāo)本HK2染色呈陽(yáng)性[26]。Tseng[4]等采用Western blotting和免疫熒光染色法分析了HK1和HK2在多種癌細(xì)胞中的表達(dá)。人宮頸癌(HeLa和SIHA)、乳腺癌(MCF 7)和前列腺癌(PC3)細(xì)胞表達(dá)大量HK1和HK2，HK1主要分布于胞漿和線粒體，而HK2主要分布在胞漿中，HK1和HK2在能量代謝中均起著重要作用[27-32]。在HK1沉默的細(xì)胞中磷酸化AMP依賴(lài)蛋白激酶(p-AMPK)水平和p-p38 MAPK蛋白水平均升高，干擾了生物能量的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致AMPK/p38MAPK通路的擴(kuò)增，從而改變了細(xì)胞的能量代謝，HK1沉默可導(dǎo)致線粒體呼吸出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，但增加葡萄糖攝取，促進(jìn)糖酵解活性。HK2的高表達(dá)導(dǎo)致p53/Tigar和SCO2通路增加糖酵解代謝。由此可見(jiàn)，HK在宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，研究HK在糖酵解途徑中的機(jī)制也將成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

2.4 PK丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2，PKM2)是糖酵解中的關(guān)鍵酶之一，廣泛存在于多種惡性腫瘤中。Lin等[5]等通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)到PKM 2在宮頸癌組織和細(xì)胞中均有高表達(dá)。已有研究表明PKM2可作為轉(zhuǎn)錄輔激活物發(fā)揮作用，PKM 2一旦進(jìn)入細(xì)胞核，可促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，如HIF-1α靶向表達(dá)的谷蛋白、PKM 2、LDH-A和VEGF-A，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、正反饋調(diào)節(jié)的糖酵解[33]。細(xì)胞膜表面的表皮生長(zhǎng)因子受體激活后的PKM2依賴(lài)的正反饋環(huán)促進(jìn)有氧糖酵解，以及上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter1，GLUT1)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDHA)的表達(dá)[34]。原癌基因Myc家族在癌癥中經(jīng)常被過(guò)度激活，并通過(guò)增加許多糖酵解酶的表達(dá)與HIF在腫瘤代謝中發(fā)揮重要的協(xié)同作用[35-36]。MYC轉(zhuǎn)錄后，GLUT 1、LDHA和PTB介導(dǎo)的PKM 2表達(dá)上調(diào)。這些限速糖酵解基因的高表達(dá)在表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的Warburg效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，其特點(diǎn)是葡萄糖攝取增加，氧氣作用下乳酸生成增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。由此可見(jiàn)，PKM2在宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，為人類(lèi)腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)。

2.5 LDH乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)也是糖代謝通路中的重要限速酶。LDH的分子量大約為140KD。一般認(rèn)為，LDH可分為L(zhǎng)DH-A和LDH-B兩種[37]。轉(zhuǎn)錄因子HIF-I和Myc在轉(zhuǎn)錄和或翻譯水平調(diào)節(jié)LDH-A基因的表達(dá)水平。c-Myc促進(jìn)線粒體谷氨酰胺代謝，導(dǎo)致進(jìn)入三羧酸循環(huán)的碳減少，并降低線粒體對(duì)糖脂生物合成的能量供應(yīng)。在結(jié)直腸癌的研究中，轉(zhuǎn)錄因子c-myc具有使糖酵解代謝相關(guān)基因表達(dá)增加和促進(jìn)LDH-A參與線粒體生物合成的作用[38]。LDH-A對(duì)腫瘤的微環(huán)境和腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移重要的影響，高表達(dá)的LDH-A與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)[39]。在腫瘤組織中高表達(dá)的LDH-A積極地將丙酮酸還原為乳酸支持癌細(xì)胞的增殖。LDH-A活性的增加也會(huì)增加乳酸的生成，從而導(dǎo)致乳酸在細(xì)胞外環(huán)境中的輸出。從惡性細(xì)胞中擴(kuò)散出來(lái)的代謝物刺激周?chē)衫w維細(xì)胞合成透明質(zhì)酸，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的重新排列，促進(jìn)侵襲性細(xì)胞的生長(zhǎng)[40]。LDH-B的表達(dá)下降與DNA的甲基化密切相關(guān)。Brown等[41]證實(shí)在人類(lèi)乳腺癌中，LDH-B亞單位的表達(dá)喪失可能發(fā)生在早期，其潛在機(jī)制可能與LDH-B啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。此外，由于LDH-B缺乏細(xì)胞在缺氧條件下表現(xiàn)出明顯的乳酸水平升高，因此LDH-B表達(dá)的減少可能為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了有利條件。由此可見(jiàn)，研究LDH在糖酵解途徑中的機(jī)制也將成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

3 結(jié) 語(yǔ)

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程又極其復(fù)雜，這為早期發(fā)現(xiàn)、干預(yù)和治療宮頸癌帶來(lái)許多困難。Warburg效應(yīng)是公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞的代謝特征之一，腫瘤性糖酵解增加糖代謝，產(chǎn)生乳酸，從而產(chǎn)生酸性和低氧的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，這與臨床和預(yù)后密切相關(guān)，為腫瘤的預(yù)防和治療提供了非常重要的理論基礎(chǔ)和研究方向。Warburg效應(yīng)及其在癌細(xì)胞中作用的廣泛研究，提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖原因的認(rèn)識(shí)，但其影響宮頸癌的發(fā)展及預(yù)后仍然有一些機(jī)制不甚明確。雖然現(xiàn)在針對(duì)Warburg效應(yīng)仍然有許多亟待解決的問(wèn)題，但隨著科學(xué)研究的不斷深入，通過(guò)干預(yù)糖酵解的關(guān)鍵酶來(lái)干擾腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)來(lái)切斷其能量生成來(lái)干預(yù)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展將逐漸成為現(xiàn)實(shí)，為臨床上的治療提供新的思路，為越來(lái)越多的宮頸癌患者帶來(lái)希望。