PCP信號(hào)通路關(guān)鍵因子VANGL在腫瘤細(xì)胞遷移和增殖中的作用研究進(jìn)展

沈書(shū)凝,徐步捷綜述,郝雷雨,朱一超審校

0 引 言

腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)平面細(xì)胞極化(planar cell polarity, PCP)通路，形成不對(duì)稱(chēng)的趨向性。Vangl蛋白是PCP通路的一個(gè)關(guān)鍵因子，其非對(duì)稱(chēng)分布與腫瘤細(xì)胞的遷移方向密切相關(guān)。本文主要介紹了Vangl的分子結(jié)構(gòu)、在PCP通路中的功能，以及總結(jié)了Vangl影響腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的最新研究方向。

1 VANGL簡(jiǎn)介

1.1 VANGL的發(fā)現(xiàn)1998年，Wolff和Rubin在果蠅中發(fā)現(xiàn)Strabismus(STBM)，這種基因能調(diào)節(jié)果蠅的復(fù)眼、鬃毛等部位亞單位的極性分布，且能決定復(fù)眼中R3、R4光感受器的細(xì)胞結(jié)局(旋轉(zhuǎn)方向等)[1]。同年，Taylor等[2]在果蠅翅膀中發(fā)現(xiàn)同一基因并命名為Van Gogh(VANG)。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化中具有高度保守性，在哺乳動(dòng)物(如人、小鼠、斑馬魚(yú)等)中存在VANG同源基因VANG-like(VANGL)，其具有兩種亞型——VANGL1和VANGL2[3-4]。VANGL1和VANGL2在分布上既有重合也有不同。VANGL1主要分布在神經(jīng)管腹側(cè)(中線(xiàn)底板區(qū))和脊索；而VANGL2在神經(jīng)上皮中分布更廣泛，但不分布于脊索。在部分組織(如耳蝸感覺(jué)上皮)，VANGL1和VANGL2均有分布，且二者在細(xì)胞膜可形成蛋白聚合體[5]。

1.2 VANGL的肽鏈結(jié)構(gòu)VANGL為四次跨膜蛋白，以VANGL1為例，其肽鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)已研究清楚，VANGL2與VANGL1序列相似度很高。VANGL1可劃分為胞內(nèi)的N端(pst.1-114)、C端(pst.242-524)、1個(gè)短loop環(huán)(pst.173-186)以及胞外2個(gè)短loop環(huán)(pst.135-152；207-221)[6]。N端和C端各存在一些結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜靶向信號(hào)和蛋白質(zhì)分選有關(guān)，參與網(wǎng)格蛋白(一種囊泡蛋白)介導(dǎo)的胞吞作用，包括：N端YSFG(pst.7-10)、YSYY(pst.10-13)、LL雙亮氨酸模體(pst.56-57)；C端YKDF(pst.284-287)、NPNL(pst.291-294)[6]。

VANGL的C端序列高度保守，可與胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合傳遞信號(hào)，如PCP相關(guān)因子Prickle(PK)、Dishevelled(DVL)[7]、垂直極化因子Scribble等[8]。C端尾部有一個(gè)PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PDZ-binding motif，PBM)，許多蛋白均有多個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，如Scribble等，但其與VANGL的相互作用是否必須通過(guò)VANGL的PBM尚有爭(zhēng)議。相比于N端，C端在VANGL的膜定位靶向運(yùn)輸中發(fā)揮更重要的作用。VANGL1部分截短實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N端缺失突變的VANGL1在膜表面的分布正常，而C端缺失突變的VANGL1轉(zhuǎn)運(yùn)失敗，滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[9]。

1.3 VANGL的膜穩(wěn)定性影響其功能實(shí)現(xiàn)

1.3.1 VANGL從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到膜表面分布的轉(zhuǎn)運(yùn)VANGL的功能實(shí)現(xiàn)與其在膜表面的定位分布密切相關(guān)。膜蛋白在胞膜的分布及穩(wěn)定性由兩方面因素影響：一是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-胞膜的囊泡運(yùn)輸過(guò)程，二是細(xì)胞內(nèi)吞-蛋白酶體/溶酶體分解蛋白途徑。VANGL2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，由COPII囊泡運(yùn)輸至高爾基體，而由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移入囊泡的過(guò)程需要Sec24b[10]。Sec24b是COPII囊泡的一個(gè)亞單元，用于分選裝載蛋白。VANGL2-Looptail(LP)雙等位基因突變鼠，三種突變位點(diǎn)(VANGL2的D255E、R259L、S464N)不能被分選打包進(jìn)COPII囊泡，滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不能表達(dá)于細(xì)胞膜上，因而VANGL2-PCP功能缺陷，造成嚴(yán)重的神經(jīng)管形成缺陷，在胚胎期小鼠就死于顱脊柱裂。

VANGL2從轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體到胞膜的囊泡運(yùn)輸需要ARFRP1(GTP結(jié)合蛋白ADP糖基化因子相關(guān)蛋白1)和AP-1(網(wǎng)格蛋白相關(guān)適配蛋白復(fù)合體1)的參與[11]。ARF蛋白結(jié)合GTP后構(gòu)象變化，暴露出N端脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與裝運(yùn)高爾基體膜結(jié)合，同時(shí)switch結(jié)構(gòu)域改變其朝向，招募胞質(zhì)內(nèi)裝載調(diào)節(jié)蛋白。ARFRP1與AP-1相互作用，使AP-1與VANGL2 C端YYXXF(pst.279-283)分選信號(hào)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而抓獲VANGL2裝載到轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡中[11]。此外，支架蛋白PDZ蛋白家族的NHERF1(Na+/H+Exchanger Regulatory Factor 1)通過(guò)2個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域分別與VANGL2和Frizzled4的PDZ結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，連接VANGL2和FZD4，從而促進(jìn)VANGL2向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。

1.3.2 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)VANGL的影響VANGL2可與整合素αv相互作用，調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附。反之，整合素αv也可作用于抑制VANGL2的降解，維持其在胞膜的表達(dá)量；敲除整合素αv或整合素β5都可發(fā)現(xiàn)VANGL2蛋白表達(dá)量減少[13]。細(xì)胞外基質(zhì)可能通過(guò)整合素與細(xì)胞連接和影響細(xì)胞內(nèi)VANGL的表達(dá)。

2 VANGL在PCP信號(hào)通路中的角色

上皮細(xì)胞在發(fā)育形成過(guò)程中會(huì)朝兩個(gè)方向軸產(chǎn)生不對(duì)稱(chēng)性極化：垂直方向頂-基底軸和平面近-遠(yuǎn)端軸。其中，沿平面軸(垂直于頂-基底軸)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)含物的非對(duì)稱(chēng)發(fā)育稱(chēng)為PCP[14]。這種非對(duì)稱(chēng)性發(fā)育，為細(xì)胞整體的非對(duì)稱(chēng)功能分區(qū)形成結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)除上皮細(xì)胞以外，間葉細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等其他細(xì)胞都廣泛存在PCP通路。

PCP信號(hào)通路建立的重要基礎(chǔ)是其核心分子的非對(duì)稱(chēng)分布。VANGL是PCP信號(hào)通路的一個(gè)核心分子，其他分子包括：Frizzled(FZ)、Flamingo(FMI/Starry night，STAN/CELSR)、Dishevelled(DSH/DVL)、Prickle(PK)、Diego(DGO/Diversin，Inversin)。其中，F(xiàn)MI、FZ、VANG位于胞膜，DSH、DGO、PK位于胞質(zhì)內(nèi)，胞膜蛋白接受信號(hào)后由胞質(zhì)內(nèi)蛋白傳遞和放大信號(hào)，細(xì)胞間信號(hào)傳遞則進(jìn)一步放大信號(hào)到鄰近組織。這些蛋白又分為兩個(gè)亞組：FMI-FZ-2DSH-1DGO(FZ在胞膜接受信號(hào)后募集胞內(nèi)2分子DSH和1分子DGO)；FMI-6VANG-1PK(VANG在胞膜接受信號(hào)，且需6個(gè)VANG召集1個(gè)PK)[15]。這樣的數(shù)量關(guān)系意味著VANG需要聯(lián)合起效，其數(shù)量的減少與其他PCP蛋白相比更敏感，更容易影響信號(hào)的傳遞。

FZ組位于細(xì)胞的遠(yuǎn)端/后部，VANG組位于細(xì)胞的近端/前部，呈相互對(duì)立的分布。且其分布與胞外WNT濃度梯度相關(guān)，F(xiàn)Z組位于WNT高濃度一端，VANG組位于WNT低濃度的一端。兩組蛋白相互拮抗，競(jìng)爭(zhēng)胞外信號(hào)，但又相互影響調(diào)控，最終共同完成前、后兩個(gè)方向上的PCP。相鄰細(xì)胞的FMI之間相互黏附形成跨細(xì)胞FMI-FMI橋，從而拉近相鄰細(xì)胞的FZ和VANG，跨細(xì)胞傳遞PCP信號(hào)。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，PCP關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞伸出的偽足中呈非對(duì)稱(chēng)分布，如乳腺癌細(xì)胞的偽足中，F(xiàn)Z6位于偽足尖端，而VANGL2位于偽足的側(cè)緣[16]。

除核心分子之外，PCP還有一套信號(hào)傳遞系統(tǒng)，即Fat-Dachsous(FT-DS)。FT與DS類(lèi)似于FZ與VANG的位置關(guān)系，即胞內(nèi)非對(duì)稱(chēng)分布，相鄰細(xì)胞的FT和DS可形成跨細(xì)胞連接。這組分子能獨(dú)立于核心分子組傳遞PCP信息，也能通過(guò)調(diào)控微管重組遷移的方向，影響微管介導(dǎo)的PCP核心分子FZ組所在囊泡的定向轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。

指導(dǎo)建立PCP的信息來(lái)源有幾種猜想：WNT、FT-DS、細(xì)胞周?chē)M織的機(jī)械力環(huán)境等。其中WNT與PCP核心分子調(diào)控的關(guān)聯(lián)性研究較多，但明確性的PCP起始驅(qū)動(dòng)力來(lái)源還處于探索中。PCP產(chǎn)生的細(xì)胞極性在內(nèi)耳聽(tīng)毛朝向、氣管/腦室中纖毛的運(yùn)動(dòng)等方面有重要影響。但PCP不僅在建立上皮細(xì)胞極性方面有重要作用，還參與胚胎發(fā)生過(guò)程中的匯聚伸展運(yùn)動(dòng)，即細(xì)胞側(cè)向插入使細(xì)胞群沿前后軸延長(zhǎng)。PCP核心分子的功能失調(diào)直接導(dǎo)致PCP建立障礙，繼而影響胚胎發(fā)育，如原腸胚形成、神經(jīng)管閉合。VANGL是人類(lèi)基因中唯一被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)管缺陷相關(guān)的基因，VANGL1突變可導(dǎo)致脊柱裂[18]，VANGL2在神經(jīng)管閉合中的作用比VANGL1更為關(guān)鍵，其突變可直接導(dǎo)致胎兒死亡[19]。

3 VANGL與腫瘤的聯(lián)系

3.1 VANGL與腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)VANGL與多種腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，但VANGL通過(guò)何種機(jī)制影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移尚處于探索階段。如VANGL1(KITENIN)在胃腸道腫瘤(如結(jié)腸癌、胃粘膜瘤)[20]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[21]、膽管癌[22]中過(guò)表達(dá)，且促進(jìn)了后三者的侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，膠質(zhì)瘤患者的VANGL1水平高低也與其腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)VANGL可促進(jìn)腫瘤的血管和淋巴管生成，促使結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[24]，這可能是VANGL影響腫瘤遷移的其中一種機(jī)制。

VANGL與乳腺癌的聯(lián)系報(bào)道較多，相較于其他腫瘤性疾病關(guān)聯(lián)性較大。VANGL2在乳腺癌上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富，但其分布不均一，在基底層細(xì)胞和間葉細(xì)胞中比導(dǎo)管上皮表達(dá)更豐富[25]。VANGL2與女性生殖系統(tǒng)、性腺癌癥有較大的關(guān)聯(lián)，在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)均上調(diào)，且侵襲性乳腺癌中VANGL2表達(dá)上調(diào)最明顯(24%表達(dá)上調(diào)，236/988)[26]。VANGL1與乳腺癌的關(guān)系則不如VANGL2突出，VANGL1表達(dá)水平與總體乳腺癌患者的總生存時(shí)間相關(guān)性不明顯，但高VANGL1表達(dá)與ER(+)乳腺癌患者的總生存時(shí)間下降相關(guān)[26]。雌激素與VANGL的關(guān)系和影響機(jī)制尚不明確。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明VANGL1與乳腺癌細(xì)胞的遷移相關(guān)，VANGL1敲除后的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞的遷移力下降。在劃痕實(shí)驗(yàn)中VANGL1與Scribble、NOS1AP形成復(fù)合物，位于向劃痕延伸的偽足前緣[27]，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞遷移并控制細(xì)胞極性(遷移方向)。該復(fù)合物只在病理?xiàng)l件下形成，而正常的乳腺細(xì)胞中NOS1AP不在細(xì)胞膜細(xì)胞連接處表達(dá)。

VANGL可與垂直極化因子Scribble、aPKC[28]相互作用，可能通過(guò)影響細(xì)胞頂—基底極化，使腫瘤細(xì)胞失去垂直極性，從上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)而增加侵襲和遷移的可能性。這為VANGL 影響腫瘤細(xì)胞遷移的分子機(jī)制提供了PCP信號(hào)通路以外的一個(gè)探索方向。

3.2 VANGL與腫瘤增殖生長(zhǎng)的關(guān)系除遷移外，VANGL在細(xì)胞增殖(腫瘤生長(zhǎng))方面也有一定作用，能通過(guò)下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)和自我更新。如橫紋肌肉瘤中，經(jīng)典WNT/β-catenin通路一般被抑制，若激活則可誘導(dǎo)腫瘤的分化；非經(jīng)典WNT/PCP通路則恰恰相反，其核心成員VANGL2位于TPC細(xì)胞分裂末期的細(xì)胞兩極，呈高表達(dá)，能激活下游RHOA，維持TPC的非分化增殖，敲降VANGL2能抑制TPC增殖而誘導(dǎo)分化[29]。

此外，VANGL2能通過(guò)p62/SQSTM1招募和激活JNK，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞極性較低的乳腺癌細(xì)胞SKBR7中，VANGL2經(jīng)蛋白酶體途徑降解多位于胞內(nèi)囊泡中，而正常情況下本該定位于細(xì)胞膜的VANGL2很少，VANGL2與p62/SQSTM1共表達(dá)于晚期內(nèi)體中。作為對(duì)照，細(xì)胞極性分化較好的IMCD3細(xì)胞中VANGL2被招募到細(xì)胞膜上細(xì)胞連接處，不與p62/SQSTM1共表達(dá)。臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)VANGL2- p62/SQSTM1-JNK通路上調(diào)的乳腺癌患者未轉(zhuǎn)移生存期較短[25]。

3.3 VANGL可能具有潛在抑癌作用盡管大部分實(shí)驗(yàn)都證明VANGL與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，提示VANGL是一種促癌分子，一小部分研究卻證明VANGL能是抑癌因子，VANGL對(duì)腫瘤的作用可能有更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。腫瘤可以重新激活一些胚胎發(fā)育相關(guān)通路，如WNT信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞樣增殖和促進(jìn)侵襲。VANGL所在的WNT/PCP通路是非經(jīng)典WNT信號(hào)傳導(dǎo)的一種，此外還有WNT/Ca2+通路等。非經(jīng)典WNT信號(hào)通路是相對(duì)于經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路而言的，非經(jīng)典WNT信號(hào)傳遞不需要依賴(lài)β-catenin。經(jīng)典WNT信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化的作用已被研究得較為透徹，而非經(jīng)典WNT通路尚在探索之中，目前認(rèn)為下游可通過(guò)小GTP酶RAC、RHO作用于細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞遷移。兩種WNT通路相互拮抗，但通過(guò)共用分子DVL相互影響。

VANGL對(duì)腫瘤的抑制作用可能是通過(guò)負(fù)調(diào)經(jīng)典WNT/β-catenin通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。VANGL1可通過(guò)C端PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBM)與DVL相互作用，減少DVL在胞膜處的募集，從而可供經(jīng)典WNT通路調(diào)用的DVL減少，實(shí)現(xiàn)對(duì)經(jīng)典WNT通路的負(fù)調(diào)，且VANGL的這種負(fù)調(diào)作用獨(dú)立于VANGL在PCP通路中的下游分子Prickle(PK)[7]。

WNT/PCP通路對(duì)腫瘤的作用究竟是促進(jìn)轉(zhuǎn)移還是負(fù)調(diào)經(jīng)典WNT通路為主抑制腫瘤生長(zhǎng)，可能與腫瘤的類(lèi)型相關(guān)，在不同的腫瘤中主導(dǎo)力量不同。結(jié)直腸癌中，經(jīng)典WNT通路占主導(dǎo)，非經(jīng)典WNT通路的VANGL2因啟動(dòng)子甲基化而被抑制表達(dá)，這種異常的DNA修飾錯(cuò)誤與不穩(wěn)定微衛(wèi)星灶型結(jié)腸癌亞型、BRAF突變相關(guān)。在甲基化程度較低的SW480亞型中過(guò)表達(dá)VANGL2后，腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移灶形成均顯著下調(diào)，且經(jīng)典WNT通路指標(biāo)(β-catenin、CyclinD1、c-Myc)被抑制[30]。因此VANGL在部分結(jié)直腸癌亞型中，可能通過(guò)負(fù)調(diào)經(jīng)典WNT通路發(fā)揮抑癌作用，只不過(guò)這種抑癌作用在腫瘤中處于被抑制的地位。

NRDP1是一種泛素連接酶，能介導(dǎo)PCP通路關(guān)鍵因子DVL的多聚泛素化，從而形成空間位阻，阻礙DVL與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酸(PA)結(jié)合，DVL下游促腫瘤遷移的通路就不得激活。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，WNT5A與FZD7受體結(jié)合，招募DVL至胞膜并活化DVL，從而激活JNK-AP1轉(zhuǎn)錄、激活小GTP酶RAC1、RHOA作用于細(xì)胞骨架的重排和腫瘤細(xì)胞遷移。腫瘤中PCP關(guān)鍵因子VANGL上調(diào)，而NRDP1受抑制。然而研究發(fā)現(xiàn)，如果NRDP1存在，能干擾FZD對(duì)DVL的結(jié)合和激活，而這種抑癌作用正是通過(guò)加強(qiáng)VANGL與DVL的結(jié)合，從而促進(jìn)DVL的泛素化失活[31]。VANGL與NRDP1作用位點(diǎn)位于VANGL的C端coiled-coil結(jié)構(gòu)域。有趣的是，檢測(cè)DVL與胞膜PA結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)NRDP1時(shí)，VANGL2能促進(jìn)DVL與PA結(jié)合；NRDP1和VANGL2共表達(dá)時(shí)，DVL與PA結(jié)合量顯著降低，甚至低于NRDP1單獨(dú)存在時(shí)DVL與PA的結(jié)合量。這可能提示NRDP1能逆轉(zhuǎn)VANGL對(duì)腫瘤的促癌作用，但還需要細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證明。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

腫瘤的發(fā)生發(fā)展多與胚胎發(fā)育通路的異常再激活相關(guān)，此類(lèi)通路包括經(jīng)典WNT通路、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變通路、PCP通路等。由于VANGL是PCP通路的關(guān)鍵因子，其表達(dá)/功能紊亂可能影響腫瘤的發(fā)生與終局。目前研究表明VANGL與乳腺癌的關(guān)系(遷移進(jìn)展)最為密切。VANGL的促癌作用還需更多分子機(jī)制研究證實(shí)，最近研究發(fā)現(xiàn)可從VANGL與腫瘤外基質(zhì)的關(guān)系、平面極化通路與垂直極化通路的交互關(guān)系等方面進(jìn)行深入探索。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)VANGL在抑癌方面也存在潛在作用，尤其是非經(jīng)典通路對(duì)經(jīng)典通路的負(fù)調(diào)控可能通過(guò)VANGL來(lái)實(shí)現(xiàn)。VANGL在促癌、抑癌的天平兩端到底哪方面占優(yōu)勢(shì)，可能與腫瘤的具體種類(lèi)和分型相關(guān)。