多發(fā)性骨髓瘤早期實(shí)驗(yàn)診斷相關(guān)新興生物標(biāo)志物的最新研究進(jìn)展

徐海燕，陸學(xué)東

（中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東深圳 518000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是骨髓中漿細(xì)胞惡性增殖并伴有單克隆免疫球蛋白分泌為特點(diǎn)的疾病，其發(fā)病率占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[1]，嚴(yán)重危害人群健康。雖然傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)診斷相關(guān)生物標(biāo)志物很多，但敏感度和特異度較低，很難對(duì)MM 進(jìn)行早期診斷和早期干預(yù)，即使MM治療方法不斷革新，但MM 的生存及預(yù)后仍不理想。隨著研究的進(jìn)展，一些新的生物標(biāo)志物被證明可預(yù)測(cè)早期MM 的疾病進(jìn)展，有利于MM 的早期診斷和后續(xù)的靶點(diǎn)治療。本文就近年來發(fā)現(xiàn)的一些潛在的MM 早期實(shí)驗(yàn)診斷相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行綜述，為提高M(jìn)M 的臨床診斷率提供理論基礎(chǔ)。

1 MM 的主要臨床表現(xiàn)

MM 的疾病進(jìn)展包括了兩個(gè)重要的前期階段，即意義不明的單克隆丙種球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma,SMM）。MGUS 進(jìn)展為MM 的速度約為每年1%，SMM 是介于MGUS 和MM 之間的惡性臨床前階段，其進(jìn)展率約為每年10%[2]。MM 惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)增殖和聚集，疾病晚期時(shí)也可見于外周血和其他軟組織器官中[3]。惡性漿細(xì)胞會(huì)過度分泌κ，λ 輕鏈，以及單克隆免疫球蛋白（monoclonal protein），即M 蛋白。該病的臨床表現(xiàn)主要由M 蛋白、游離輕鏈、惡性漿細(xì)胞或惡性漿細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子引起，最終造成終末性的器官損害，如高鈣血癥（hypercalcemia）、腎功能不全（renal insufficiency）、貧血（anemia）以及骨?。╞one disease），即典型的CRAB 征[4-5]。MM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)就是根據(jù)輕鏈、M蛋白的水平、骨髓中克隆漿細(xì)胞的浸潤以及新確認(rèn)的生物標(biāo)志物和CRAB 特性而制訂的。用于MM的實(shí)驗(yàn)診斷的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物雖有很多種，但MM的生存率仍然很低，因此，需要鑒定一些更敏感的生物標(biāo)志物來提高M(jìn)M 的早期診斷率。

2 骨髓微環(huán)境中的標(biāo)志蛋白

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)蛋白 骨髓微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal stem cells,BMSCs）在MM 進(jìn)程中起著重要作用，研究顯示，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞與BMSCs 或骨祖細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，吻素受體（KISSIR）的表達(dá)在這些細(xì)胞中均上調(diào)[6]，進(jìn)而抑制成骨分化。從MM 患者骨髓液中分離得到的BMSCs 進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察到BMSCs 分泌的白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、生長分化因子15 和轉(zhuǎn)化生長因子-β 等骨髓惡性漿細(xì)胞增殖有關(guān)因子水平升高，而且還觀察到MM 患者的BMSCs 中分泌型蛋白dickkopf-1，IL-3 和IL-7 等抑制成骨分化相關(guān)的因子表達(dá)水平比健康對(duì)照組高[7]。此外，有研究表明，與健康對(duì)照組相比，MM 患者BMSCs 中產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinases 1,MMP-1），MMP-2 和趨化因子CXCL13 等的表達(dá)顯著增加，促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。BMSCs 中這些差異表達(dá)的因子促進(jìn)了MM 及其骨病的進(jìn)展，這些新的生物標(biāo)志物有可能用作早期敏感的MM 或骨髓瘤骨病的實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

2.2 骨髓細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）由膠原、纖維蛋白原、蛋白多糖和其他參與細(xì)胞黏附、遷移和分化的蛋白質(zhì)組成。骨髓ECM 與細(xì)胞間的相互作用在骨髓瘤細(xì)胞歸巢和增殖分化中起重要作用。有研究觀察到，MGUS 及MM 患者骨髓ECM 中雙糖鏈蛋白多糖Biglycan，纖溶酶原激活物抑制因子1、骨膜素表達(dá)水平增多，纖連蛋白fibulin-2，蛋白賴氨酸6-氧化酶及幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1 表達(dá)減少，這些差異性表達(dá)的ECM 蛋白可促進(jìn)MM 惡性漿細(xì)胞的黏附、侵襲、遷移及增殖[10]。骨髓成纖維細(xì)胞表面血小板源性生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptorβ,PDGFR-β）也參與腫瘤細(xì)胞遷移，有研究報(bào)道，PDGFR-β 在MGUS 患者的骨髓成纖維細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，并且在MM 患者的相應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)水平進(jìn)一步升高，而在正常者中PDGFR-β 的表達(dá)量極低，因此，PDGFR-β 可能作為MM 病程逐漸進(jìn)展的標(biāo)志蛋白。Versican 是一種ECM 硫酸軟骨素蛋白聚糖，與多種癌癥的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，研究顯示，MM 患者骨髓及血清中Versican 表達(dá)水平均明顯升高，其水平與血清β2-微球蛋白（β2-microglobulin,β2-MG）和M 帶呈正相關(guān)，而且血清中Versican 的ROC 曲線分析顯示其具有較高的敏感度和特異度，表明Versican 也可能被用作MM潛在的實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)志物[11]。

2.3 血管生成相關(guān)蛋白 腫瘤的生長都需要有效的血液供應(yīng)，血管生成是MM 進(jìn)展的一個(gè)持續(xù)特征。研究表明，從MGUS，SMM 到新診斷的MM 和復(fù)發(fā)性MM，骨髓血管生成程度逐漸增加，而且，骨髓微血管密度增加是MM 患者重要的診斷/預(yù)后因素[12]。研究顯示，骨髓惡性漿細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和肝細(xì)胞生長因子等促血管生成因子水平增多，VEGF 的表達(dá)量與MM 病情的嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。微血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞會(huì)響應(yīng)VEGF 刺激而分泌IL-6，IL-6 是骨髓瘤細(xì)胞的有效生長因子，反過來又促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞分泌VEGF[14]。此外，血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）可通過增強(qiáng)VEGF 的作用來促進(jìn)腫瘤血管生成，Ang-1 與之作用相反。有研究表明，與健康人比，新診斷或復(fù)發(fā)/難治性MM 患者血清Ang-1/Ang-2 比值下降[15]。另外，MM 患者的血清Ang-2 水平隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，而且Ang-2 水平與血清β2-MG 水平及骨受累程度呈正相關(guān)，Ang-2 和VEGF 檢測(cè)的敏感度和特異度也較高，表明Ang-2，VEGF 可與β2-MG 一起作為MM 診斷或預(yù)后的潛在標(biāo)志物[16]。

3 非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）包括微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA），這些ncRNA 在MM 疾病進(jìn)程中均起著重要作用。MM 患者外周血清的基因陣列分析發(fā)現(xiàn)三種表達(dá)差異較大的miRNA（miR-720，miR-1308 和miR-1246），這三種miRNA 對(duì)于區(qū)分健康對(duì)照、MGUS 及MM 患者的敏感度和特異度較高[17]。一些miRNA 還與許多常見的MM 實(shí)驗(yàn)室生物標(biāo)志物顯著相關(guān)。血清miR-214 和miR-135b 的表達(dá)水平可反映出骨病變的嚴(yán)重程度，能夠區(qū)分有或不伴有骨病的MM 患者，可能成為替代影像學(xué)檢查來鑒定MM 相關(guān)骨疾病的有力實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)。而且，血清miR-744，miR-130a，let-7d 和let-7e 水平與MM 患者的血紅蛋白水平、血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，與肌酐、β2-MG 呈負(fù)相關(guān)，let-7e 的表達(dá)還與M 蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，這些miRNA 可能成為MM 的早期敏感生物標(biāo)志物[18-19]。

血清中異常表達(dá)的LncRNA 同樣影響著MM的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，MM 患者血清中LncRNA MALAT-1，PDIA3P 表達(dá)上調(diào)，可抑制腫瘤細(xì)胞死亡或凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而且PDIA3P還能增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性[20-21]。MM 患者血清IncRNA H19 也上調(diào)，臨床病理學(xué)分析顯示，IncRNA H19 的表達(dá)水平可以作為MM 臨床分期的輔助標(biāo)志物[22]。MM 的BMSCs 中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平降低，能夠抑制BMSCs 成骨分化，促進(jìn)MM 的骨質(zhì)破壞[23]。這些lncRNA 表達(dá)水平的變化可估計(jì)疾病的嚴(yán)重程度，有助于MM 的早期診斷。

circRNA 在MM 中的研究較少，但也有研究表明circRNA 在骨髓瘤中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MM 腫瘤細(xì)胞中hsa_circ_0007841 及hsa_circ RNA_101237 明顯上調(diào)，促進(jìn)了MM 的溶骨性病變及腫瘤細(xì)胞耐藥性[24-25]。circ0000190 在MM 骨髓組織和外周血中均表達(dá)下降，促進(jìn)了骨髓瘤細(xì)胞增殖[26]。這些研究暗示了circRNA 具有作為MM 的新型實(shí)驗(yàn)診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的潛力。

4 循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤DNA

外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells,CTCs）或循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是特征性的腫瘤生物標(biāo)記。CTCs 是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤部位脫落進(jìn)入到循環(huán)中的細(xì)胞，因此，它可準(zhǔn)確反映疾病狀況[27]。通過多參數(shù)流式細(xì)胞儀，可檢測(cè)到從MM 患者骨髓進(jìn)入到外周血的克隆性循環(huán)漿細(xì)胞，即骨髓瘤CTCs。研究表明，在新診斷的MM 患者中，400 個(gè)以上骨髓瘤CTCs的存在與較高的腫瘤增殖、不良的細(xì)胞遺傳學(xué)、較低的總體生存率及較高的復(fù)發(fā)率相關(guān)[28]。另一項(xiàng)研究表明，超過100 個(gè)骨髓瘤CTCs 預(yù)示活動(dòng)性MM復(fù)發(fā)患者的生存率較差[29]。此外，SMM 患者中高水平的CTCs 與其2～3年發(fā)展為MM 的風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)[30]。研究還顯示，MM 患者CTCs 攜帶的突變比例與骨髓克隆漿細(xì)胞的突變基本一致，外周血也許能用來確定MM 患者在疾病表現(xiàn)和進(jìn)展過程中的突變情況[31]。這些數(shù)據(jù)表明CTCs 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有助于MM 的早期診斷，并預(yù)測(cè)MM 患者的疾病狀態(tài)和生存率。

ctDNA 是由腫瘤細(xì)胞的DNA 片段釋放入循環(huán)系統(tǒng)的胞外DNA，全面反映了腫瘤細(xì)胞的遺傳復(fù)雜性和異質(zhì)性[32]。研究顯示，MM 患者ctDNA 和骨髓樣本的突變基因是一致的，ctDNA 對(duì)骨髓克隆突變和亞克隆突變的敏感度較高，分別為100%和96%[33]。研究還發(fā)現(xiàn)，高水平的ctDNA 與早期疾病復(fù)發(fā)相關(guān)，患者總體生存率明顯較差，且ctDNA中TP53 突變比例比骨髓高，可能有助于MM 的早期診斷和預(yù)后[34]。與其他蛋白質(zhì)標(biāo)志物相比，ctDNA 的半衰期不到3 h，這表明它可以反映MM患者的實(shí)時(shí)腫瘤負(fù)擔(dān)，也可以在常規(guī)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物和成像技術(shù)之前檢測(cè)到腫瘤動(dòng)力學(xué)的變化，比CTCs 和蛋白生物標(biāo)志物更敏感和特異[32]。

5 展望

MM 的病理過程復(fù)雜，其早期實(shí)驗(yàn)診斷較困難，通過全面研究骨髓微環(huán)境中基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、外周血中ncRNAs，CTCs 以及ctDNA 等潛在生物標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)在早期階段識(shí)別和治療MM 患者具有重要意義。此外，外周血中ncRNAs 的檢測(cè)，以及在血液活檢中對(duì)CTCs 和ctDNA 的檢測(cè)，可以幫助臨床醫(yī)生在不進(jìn)行侵入性骨髓檢查的情況下評(píng)估疾病狀態(tài)并早期診斷MM。這些新興的生物標(biāo)志物已展現(xiàn)出對(duì)MM 的診斷和預(yù)后潛力，但是上述生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化，仍需要不斷地進(jìn)行試驗(yàn)和驗(yàn)證之后，才能在未來的MM 臨床檢驗(yàn)中得到應(yīng)用。