長鏈非編碼RNA調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞增殖分化和在免疫性疾病中的最新研究進(jìn)展

劉立民，劉雪香，鄒 燕，黃志卓

（柳州市工人醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣西柳州 545005）

1 lncRNA 概述

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是一類長度超過200 nt 且無編碼蛋白能力的RNA 序列。lncRNA 轉(zhuǎn)錄過程與信使RNA 類似，主要由RNA 聚合酶II 參與，部分lncRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，形成3’poly 加尾和5’cap 帶帽結(jié)構(gòu)。lncRNA 的表達(dá)通常具有細(xì)胞特異性和時空特異性，其可分布在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)或者兩者中均有。lncRNA 在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯以及翻譯后的修飾等水平，通過多種機(jī)制如基因組因子、染色體重塑、作為海綿體吸附微小RNA，作為中間體連接RNA 與蛋白和DNA 形成調(diào)控復(fù)合物等，調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖、發(fā)育、成熟和分化[1]。lncRNA 在免疫細(xì)胞和免疫性疾病的作用和機(jī)制的研究處于起步階段，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2 lncRNA 與CD4+T 淋巴細(xì)胞

CD4+T 淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，主要包括Th1, Th2, Th17, Tfh, Th9, Th10, Th22, Treg 和Tfr 等[2]。CD4+T 細(xì)胞相互配合共同維持適應(yīng)免疫應(yīng)答的平衡。機(jī)體免疫功能異常致CD4+T 細(xì)胞亞群比例失調(diào)，可能引起免疫失衡甚至引起免疫性疾病[3]。lncRNA 在調(diào)控CD4+T 細(xì)胞的增殖分化和功能研究以及在相關(guān)免疫性疾病的作用已有報道，本綜述簡要匯總lncRNA 在調(diào)控CD4+T細(xì)胞增殖分化和在免疫性疾病中的研究進(jìn)展。

2.1 lncRNA 與Th1 細(xì)胞 Th1 細(xì)胞主要參與抗病毒、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞免疫和遲發(fā)型超敏反應(yīng)等[4]。通過人的T 細(xì)胞亞群RNA-seq 數(shù)據(jù)分析，linc-MAF-4 被鑒定出來，定位在MAF 基因（Avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog，MAF）上游139.5kb。linc-MAF-4 是Th1 細(xì)胞特異性表達(dá)的lncRNA，主要功能是抑制MAF 的表達(dá)。linc-MAF-4 直接與果蠅zeste 基因增強(qiáng)子的人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和賴氨酸特異性組蛋白脫甲基酶1A（lysine-specific histone demethylase 1A，LSD1）相互作用形成復(fù)合物沉積在MAF 的啟動子區(qū)域，增強(qiáng)MAF 的H3K27 me3 水平沉默MAF 表達(dá)。人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）敲除linc-MAF-4 后，引起CD4+T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化偏移。人的naive CD4+T 細(xì)胞過表達(dá)linc-MAF-4 后，可促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化并抑制Th2 細(xì)胞分化，上述研究表明linc-MAF-4 促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化的重要分子之一[5]。NeST（Nettoie Salmonella pasTheiler’s，NeST）也是Th1 細(xì)胞特異表達(dá)的lncRNA，位于干擾素-γ 基因（interferon-γ，IFN-γ）的反義鏈上。在人和鼠的CD4+T 細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化中發(fā)現(xiàn)IFN-γ 和NeST 在Th1 細(xì)胞表達(dá)最高。體外誘導(dǎo)D011.10.Stat4 ?/? 和DO11.10.Tbx21 ?/?小鼠的Th1 細(xì)胞，IFN-γ 和NeST 在Th1 細(xì)胞的表達(dá)均顯著降低。在NeST 敲低后的細(xì)胞，IFN-γ 的表達(dá)降低。ChIP-qPCR 實驗證明NeST 與WDR5 相互作用。在過表達(dá)NeST 的小鼠模型，明顯促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，并且IFN-γ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的H3K4 me3 的水平增加[6]。因此，Th1 細(xì)胞的NeST 對IFN-γ 的表達(dá)發(fā)揮了重要作用。NKILA（NF-κB-interacting long noncoding RNA，NKILA)是一種與NF-κB 相互作用的長鏈非編碼RNA，通過抑制NF-κB 活性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞對活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。T 細(xì)胞受體信號激活引起鈣離子流向T 細(xì)胞的激活鈣調(diào)蛋白，引起NKILA 啟動子區(qū)去乙?；笢p少進(jìn)而增強(qiáng)STAT1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。

2.2 lncRNA 與Th2 細(xì)胞 Th2 細(xì)胞協(xié)助B 細(xì)胞誘發(fā)體液免疫應(yīng)答、清除細(xì)胞外微生物和腸道蠕蟲等寄生蟲。Th2 細(xì)胞參與抗體類別轉(zhuǎn)換促進(jìn)產(chǎn)生IgE，引起或維持過敏反應(yīng)。在IL-4 刺激下，誘導(dǎo)STAT6 磷酸化，激活Th2 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3，引起Th2 細(xì)胞分化[7]。在Th2 細(xì)胞中特異性表達(dá)的lncRNA GATA3-AS1 位于GATA3 基因的反義鏈上，是反義lncRNA，主要分布在細(xì)胞核中。在PBMC 中通過小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）敲除GATA3-AS1，體外Th2 誘導(dǎo)分化條件下，GATA3，IL-13 和IL-5 的mRNA 和蛋白水平都明顯降低。ChIP-qPCR 實驗顯示，細(xì)胞敲除GATA3-AS1 后，GATA3 和GATA3-AS1 基因的H3K4 me2/3 和H3K27ac 的修飾水平降低。具體機(jī)制是GATA3-AS1 和GATA3-AS1 內(nèi)含子DNA形成R 環(huán)，同時GATA3-AS1 與染色質(zhì)修飾蛋白MLLH3k4 結(jié)合，抑制目的基因轉(zhuǎn)錄。雖然GATA3-AS1 不能誘導(dǎo)Th2 表型，但是GATA3-AS1 不僅調(diào)節(jié)GATA3 和Th2 效應(yīng)細(xì)胞因子IL-5 和IL-13 的表達(dá)，而且可以修飾GATA3 和GATA3-AS1 的染色質(zhì)分布[8]。lincRNA LincR-Ccr2-5’AS 在Th2 細(xì)胞中特異性高表達(dá)，調(diào)控Th2 細(xì)胞特異表達(dá)的基因和Th2 細(xì)胞的遷移。在Th2 細(xì)胞中通過使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲 除LincR-Ccr2-5’AS 后，Th2 細(xì)胞表面分子CCR1，CCR3，CCR2，CCR5表達(dá)下降；C57BL/6 小鼠敲除LincR-Ccr2-5’AS 基因后，肺部遷移的Th2 細(xì)胞明顯低于正常對照組。LincR-Ccr2-5’AS 調(diào) 控CCR 基因(C-C chemokine receptor，CCR)表達(dá)與修飾染色質(zhì)的可接近性和招募RNA 聚合酶II 無關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚[9]。lncRNA NEAT1（nuclear enriched abundant transcript，NEAT1）促進(jìn)Th2 細(xì)胞的分化，RIP 實驗證明NEAT1 與EZH2 結(jié)合，被募集到ITCH 啟動子區(qū)域，抑制ITCH 表達(dá)，降低STAT6 泛素化，促進(jìn)了IL-4，IL-5 和IL-13 的表達(dá)[10]。TH2-LCR（locus control region，LCR）是一組lncRNA 簇，人類編碼Th2-LCR lncRNA 基因與RAD50 基因重疊，小鼠的與TH2 基因座控制區(qū)（LCR）相鄰。TH2-LCR 在Th2 細(xì)胞中特異性高表達(dá)，主要分布在細(xì)胞核中，包含四種可變剪切序列，調(diào)控Th2 細(xì)胞分泌IL-4，IL-5，IL-13 的表達(dá)[11]。

2.3 lncRNA 與Th17 細(xì)胞 Naive CD4+T 細(xì)胞在IL-1β，IL-6，IL-23 和TGF-β 等細(xì)胞因子刺激下，激活SOCS1，SMAD7 和STAT3 信號，引起RORγt 轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，分泌IL-17，IL-17F 和IL-22細(xì)胞因子，分化為Th17 細(xì)胞[12]。lncRNADDIT4主要表達(dá)在Th17 細(xì)胞中，位于DDIT4 基因(DNA damage-inducible transcript 4，DDIT4) 的下游，提示lncRNADDIT4 具有潛在調(diào)控功能。DDIT4是胞漿蛋白，在DNA 損傷中表達(dá)上調(diào)且抑制mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）的激活[13-14]。人naive CD4+T 細(xì)胞中敲除lncRNADDIT4，在Th17 的誘導(dǎo)條件下，DDIT4 表達(dá)降低、DDIT/mTOR 信號增強(qiáng)且促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化。相反，人naive CD4+T 細(xì)胞中過表達(dá)lncRNADDIT4，在Th17 誘導(dǎo)條件下，DDIT4 表達(dá)增加、DDIT/mTOR 信號減弱且Th17 抑制細(xì)胞分化。NEAT1 調(diào)控Th17 細(xì)胞分化，當(dāng)敲除NEAT1后，可促進(jìn)下游分子STAT3 泛素化，抑制Th17 細(xì)胞分化[15]。IL-23/STAT3 信號通路在促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化中起到主要作用。lncRNA-1700040D17Rik是EAE 模型小鼠的lncRNA 微陣列篩選表達(dá)降低的lncRNA；內(nèi)源性IL-23 拮抗劑rhIL23R-CHR 處理EAE 模型小鼠后，lncRNA-1700040D17Rik 表達(dá)顯著增加。lncRNA-1700040D17Rik 通過調(diào)控Th17 細(xì)胞的RORγt 表達(dá)，影響Th17 細(xì)胞分化。lncRNA-1700040D17Rik 調(diào)控Th17 細(xì)胞分化，可能作為自身免疫性疾病的治療靶標(biāo)或生物標(biāo)志物[16]。通過微陣列熱圖篩選哮喘患者的外周血CD4+T 細(xì)胞表達(dá)的差異lncRNA 和microRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNAMEG3 明顯升高，microRNA-17 明顯下降。CD4+T細(xì)胞敲除lncRNA-MEG3 后，抑制Th17 細(xì)胞分化；過表達(dá)lncRNA-MEG3 后，促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化。MicroRNA-17 作用于靶基因RORγt，引起RORγt mRNA 穩(wěn)定性下降。lncRNA-MEG3 通過抑制microRNA-17 的水平，促進(jìn)RORγt 的mRNA和蛋白表達(dá)，提示lncRNA/microRNA 軸可能在疾病的臨床治療和診斷中具有潛在的應(yīng)用價值[17]。

2.4 lncRNA 與Treg 細(xì)胞 NaiveCD4+T 細(xì)胞在IL-2 和TGF-β 等細(xì)胞因子刺激下分化為Treg 細(xì)胞。Treg 細(xì)胞高表達(dá)的Foxp3，激活SOCS1，SMAD3，STAT3，STAT5 和mTOR 信 號，促 進(jìn)TGF-β 分泌，在維持免疫自穩(wěn)定和自身耐受中發(fā)揮作用[18]。Flicr 是Treg 細(xì)胞中特異性低表達(dá)的lncRNA，位于Foxp3 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.8kb。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Flicr，Treg 細(xì)胞的Foxp3 轉(zhuǎn)錄增加，說明Flicr 抑制Treg 細(xì)胞Foxp3 表達(dá)。Flicr 抑制Foxp3基因表達(dá)的機(jī)制是CNS2（conserved noncoding sequence，CNS）的增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)CpG 簇處的甲基化水平增加，進(jìn)而抑制了染色質(zhì)可及性。IL-2 招募轉(zhuǎn)錄因子STAT5b 到Foxp3 基因座，穩(wěn)定Foxp3的表達(dá)。Flicr 和IL-2 在維持Treg 細(xì)胞數(shù)量動態(tài)平衡中發(fā)揮相反的作用[19]。lncRNA-EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)在Treg 細(xì)胞表達(dá)上調(diào)并且與肝細(xì)胞癌腫瘤大小和EGFR/Foxp3 的表達(dá)呈正相關(guān)，與IFN-γ 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。lncRNAEGFR 通過EGFR 依賴性方式刺激Treg 細(xì)胞分化、抑制CTL 活性并促進(jìn)HCC 生長。c-CBL（casitas B lineage lymphoma，c-CBL）是激活下游AP-1/NF-AT1 軸的重要蛋白，通過泛素化的方式降解EGFR。lnc-EGFR 與EGFR 特異性結(jié)合，降低了c-CBL 引起EGFR 泛素化的水平，有利于腫瘤的生長[20]。乳腺癌患者外周血Treg 細(xì)胞比例增加，CD4+T 細(xì)胞高表達(dá)lncRNA-SNHG1，F(xiàn)oxp3，IL-10和IDO（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO），低表達(dá)miR-448。CD4+T 細(xì)胞敲除lncRNA-SNHG1，可以降低Foxp3，IL-10和IDO表達(dá)，增加miR-488表達(dá)，抑制Treg 細(xì)胞分化。RIP 和RNA pull-down 等實驗證明lncRNA-SNHG1 靶向結(jié)合miR-448，抑制miR-448 下調(diào)IDO 的功能。小鼠敲除lncRNA-SNHG1 的模型顯著的減小腫瘤體積，延緩腫瘤發(fā)展[21]。

3 lncRNA 與免疫性疾病

lncRNA 參與免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在免疫病理和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本文簡要匯總lncRNA 在免疫性疾病中的研究進(jìn)展。

3.1 lncRNA 與過敏 在過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的發(fā)生過程中，Th1/Th2 比例下降。AR患者鼻黏液（AR-EXO）和鼻上皮細(xì)胞（OVA-EXO）的外泌體中高表達(dá)長非編碼RNAGAS5（LncGAS5）。lncGAS5 抑制Th1 細(xì)胞分化并促進(jìn)Th2 細(xì)胞分化。lncGAS5 通過抑制AR-EXO 細(xì)胞的EZH2 和T-bet轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而抑制了Th1 細(xì)胞分化。因此，AR 上皮來源外泌體中的lncGAS5 是Th1/Th2 分化的關(guān)鍵因子，為AR 提供了可能的治療靶標(biāo)[22]。Th2-LCR lncRNA 調(diào)控IL-4，IL-5，IL-13 的表達(dá)，影響Th2細(xì)胞分化。當(dāng)敲除Th2-LCR lncRNA 后，CHIPqPCR 實驗顯示招募WDR5 到IL-4，IL-5，IL-13 啟動區(qū)的水平明顯下降，引起啟動子區(qū)H3K4 me3 明顯降低，導(dǎo)致IL-4，IL-5，IL-13 合成減少。

哮喘患者外周血lncRNA-MALAT1 高表達(dá)和miR-155 低表達(dá)，引起Th1/Th2 比值降低。在CD4+T 細(xì)胞中過表達(dá)pcDNA3.1-MALAT1 后，抑制miR-155 表達(dá)，同時IFN-γ，IL-2 和T-bet 表達(dá)下降；敲除MALAT1 后促進(jìn)miR-155 表達(dá)，IL-4，IL-10 和GATA3表達(dá)增加。lncRNA-MALAT1 的表達(dá)與Th1/Th2 比例呈負(fù)相關(guān)，而miR-155 表達(dá)與Th1/Th2 比例呈正相關(guān)。MALAT1 充當(dāng)海綿體吸附miR-155，減弱miR-155 降解靶基因的能力。因此，通過調(diào)控lncRNA-MALAT1 和miR-155 的表達(dá)來調(diào)節(jié)Th1/Th2 的比例，可能成為治療哮喘的靶點(diǎn)[23]。

3.2 lncRNA 與自身免疫性疾病 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的PBMC 中Th17細(xì)胞的NEAT1 表達(dá)升高，小鼠體內(nèi)注射siRNANEAT1 可以降低Th17 細(xì)胞表達(dá)，緩解II 型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎程度[15]。多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）患者PBMC 的微陣列數(shù)據(jù)顯示，Th17 細(xì)胞中的DDIT4 和lncRNA DDIT4 上調(diào)[24]。

免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）患者的PBMC 和ITP 小鼠脾臟細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5 表達(dá)均下調(diào)。在Naive CD4+T 細(xì)胞中過表達(dá)lncRNAGAS5，抑制Th17 細(xì)胞分化，但不影響Treg 細(xì)胞分化。lncRNAGAS5促進(jìn)TRAF6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）介導(dǎo)的STAT3 泛素化，抑制Th17 細(xì)胞分化并減輕ITP[25]。Treg/Th17 細(xì)胞比例平衡在維持免疫穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，但是ITP 患者Treg/Th17 細(xì)胞比例存在失衡。ITP 患者外周血CD4+T 細(xì)胞的lncRNAMEG3 表達(dá)明顯升高。lncRNA-MEG3 直接結(jié)合miR-125a-5p，競爭性的抑制了Foxp3 表達(dá)，促進(jìn)RORγt 表達(dá)，促使Treg/Th17 細(xì)胞比例失衡，引發(fā)ITP[17]。

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis，HT）患者NeST 表達(dá)水平與循環(huán)Th1 細(xì)胞數(shù)量，T-bet 和IFN-γ 呈現(xiàn)正相關(guān)性，增強(qiáng)Th1 細(xì)胞清除病毒和細(xì)菌感染的能力[26-27]。

4 小結(jié)

lncRNA 在調(diào)控CD4+T 淋巴細(xì)胞的增殖分化和免疫疾病中具有重要作用。但是其作用和機(jī)制研究還不夠全面深入，例如lncRNA 在調(diào)控Tfh，Th9，Th10，Th22 細(xì)胞功能和機(jī)制研究鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報道。lncRNA 可能成為免疫相關(guān)疾病如自身免疫性疾病的預(yù)防、診斷及治療提供新的對策。