探討多重PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用與展望

□ 閆倩倩 秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心

多 重PCR技 術(shù) 于1988年 被Chamberlain等研究人員提出，經(jīng)過多年的發(fā)展，在病原體檢測、遺傳病檢測等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以及食品病原微生物檢測、食品原料溯源等食品領(lǐng)域取得了較大的發(fā)展。本文主要從食品安全檢測方面來探討多重PCR技術(shù)的應(yīng)用途徑及其具體的展望，目的是進(jìn)一步探索其利用空間，推動其更為廣泛的應(yīng)用，以此來保障當(dāng)前市場上的食品安全。

1 多重PCR技術(shù)概述

多重PCR技術(shù)又稱復(fù)合PCR技術(shù)、多重引物PCR，是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行不斷改進(jìn)，形成的一種應(yīng)用范圍更廣、更加有效的PCR新技術(shù)。一般情況下PCR技術(shù)會選擇單一引物來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，但是多重PCR技術(shù)會在本身體系結(jié)構(gòu)中增添更多的引物來進(jìn)行擴(kuò)增，目標(biāo)片段之間有著較大的差異性，因此在經(jīng)過多重PCR技術(shù)擴(kuò)增后，凝膠成像能直接進(jìn)行分析，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)可節(jié)約成本、時(shí)間以及模 板DNA。

多重PCR技術(shù)以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用脫氧核糖核苷酸、多對引物、模板DNA，并依靠DNA聚合酶進(jìn)行促合成反應(yīng)，其表現(xiàn)出一定的高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡便性。在高效性方面，在同一階段、同一體系中能夠利用該項(xiàng)技術(shù)檢測多種形式的病原菌以及目標(biāo)基因等；在系統(tǒng)性方面，該項(xiàng)技術(shù)可同時(shí)檢測同一癥狀不同形式的病原菌，提升檢測效率；在經(jīng)濟(jì)性方面，同一體系能夠完成多種形式的反應(yīng)，較大程度地縮短了檢測時(shí)間、節(jié)省了檢測材料[1]。

2 多重PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

2.1 單一病原細(xì)菌檢測

2.1.1 沙門菌檢測

沙門菌血清型復(fù)雜，應(yīng)用常規(guī)PCR檢測會出現(xiàn)假陽性，其本身特異性較差，因此有較大的局限性。多重PCR技術(shù)可選擇沙門菌中數(shù)個(gè)相對保守的基因序列，以引物來實(shí)現(xiàn)自身的擴(kuò)增，以此來凸顯自身的特異性特征，并降低假陽性的出現(xiàn)。沙門菌能導(dǎo)致人體出現(xiàn)傷寒、敗血癥等疾病，在設(shè)計(jì)其具體的引物基因時(shí)可從血清型與血清群兩種形式的特異性基因著手。部分學(xué)生在綜合分析了各種類型沙門菌具體類型后，對其進(jìn)行了專項(xiàng)引物設(shè)計(jì)，然后依次為基礎(chǔ)應(yīng)用多重PCR技術(shù)進(jìn)行對應(yīng)的檢測工作，發(fā)現(xiàn)可特異性檢出腸炎沙門菌的敏感度達(dá)到了95%，遠(yuǎn)高于一般細(xì)菌學(xué)檢測的92.5%

2.1.2 副溶血性弧菌檢測

副溶血性弧菌較為常見，主要存在于近海貝類、魚類等海產(chǎn)品中，會引發(fā)心臟病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、食物中毒等病癥。Bej等結(jié)合相對耐熱直接溶血素的crh基因、耐熱直接溶血素的tdh基因以及副溶血性弧菌編碼不耐熱溶血素的dh基因進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)，緊接著應(yīng)用多重PCR檢測樣品中包含的副溶血性弧菌，發(fā)現(xiàn)其特異性強(qiáng)、敏感性高，能夠很好地進(jìn)行毒株與非產(chǎn)毒株區(qū)分，相比于傳統(tǒng)形式的病菌測試有著較大的優(yōu)勢[2]。

2.2 多重PCR檢測

2.2.1 多重PCR檢測多種病原菌

在一根PCR反應(yīng)管中，同一階段在反應(yīng)管中加入各種病原菌引物，通過種方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能對其中存在的病原細(xì)菌進(jìn)行多方面的檢測，從而發(fā)掘其中存在的各種形式的病原細(xì)菌。目前很多病原菌只需少量即可對人體造成較大的威脅，1 cfu至10 cfu的菌體細(xì)胞已能夠致命。Ramesh等對現(xiàn)行的DNA提取方式進(jìn)行了改良，選擇多重PCR進(jìn)行牛奶中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與金黃色葡萄球菌的檢測，且不需要再進(jìn)行增菌檢測，敏感性為104cfu/mL，但需雜交鑒定PCR產(chǎn)物。但是以上方法在一些層面仍舊難以滿足食品樣品檢測在敏感性方面的要求，因此需對食品樣品目標(biāo)菌實(shí)施增菌 培養(yǎng)[3]。

一般情況下，一種病原細(xì)菌對應(yīng)一種類型的增菌培養(yǎng)基，因此應(yīng)用多重PCR進(jìn)行檢測時(shí)就需含有多種病原細(xì)菌的培養(yǎng)基來支持，提升檢測效率的同時(shí)降低成本。應(yīng)用較多的非選擇性增菌培養(yǎng)基包括：蛋白緩沖水、胰酶大豆肉湯、營養(yǎng)肉湯等，當(dāng)前研究階段能同時(shí)集聚各種類型病原細(xì)菌的培養(yǎng)基不多，其中應(yīng)用較為普遍的是預(yù)增菌肉湯，其具備單核增生李斯特菌、大腸桿菌、沙門菌等多種原細(xì)菌。Kawasaki S等借助多重PCR同一時(shí)間點(diǎn)檢測肉類中包含的大腸桿菌、李斯特菌、沙門菌，應(yīng)用預(yù)增菌肉湯，并進(jìn)行增菌，能使之達(dá)到1 cfu/25g的檢測敏感性[4]。

2.2.2 真?zhèn)舞b別檢測

對食品真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別很有必要，特別對肉類加工食品進(jìn)行鑒別可避免無良廠商以次充好，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對動植物源性、肉類摻假的成分進(jìn)行檢測，能取得較好的檢測效果。在鑒定肉類食品成分時(shí)，通常會選 擇 位 于mtDNA上 的165rDNA、12SrDNA、細(xì)胞色素b基因等，對各種形式的物種而選擇對應(yīng)的特異性引物，鑒定不同種類肉類成分的加工食 品。Yin等 以12SrDNA為基礎(chǔ)進(jìn)行了三對引物的設(shè)計(jì)，使得在檢測耗牛肉與普通牛肉的二元混合物時(shí)檢出限達(dá)0.1%。而Soares等通過多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了家禽、反芻動物、豬等肉類食品的檢測。而蘇葳藝等則是對牛肉樣品中的鼠肉、雞肉、豬肉成分等進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增，檢出限 達(dá)1%。

3 多重PCR技術(shù)應(yīng)用展望

多重PCR技術(shù)，突出快速高效以及節(jié)約成本的特點(diǎn)，可進(jìn)行多種目標(biāo)片段的同時(shí)檢測，并且在未來會實(shí)現(xiàn)與其他方式結(jié)合應(yīng)用，比如AFLP多重、多重逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量多重等方面的PCR技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于食品檢測的各個(gè)方面。此外，還會集中在以下3個(gè)方面：①引物對數(shù)會基于各方面的需求而不斷增加、擴(kuò)增效率此時(shí)也會同步提高；②反應(yīng)條件在各種應(yīng)用環(huán)境下會得以優(yōu)化，擴(kuò)增效率在不斷提升的同時(shí)，檢出限出現(xiàn)降低趨勢；③與其他形式的分子生物學(xué)技術(shù)能夠進(jìn)行結(jié)合使用，檢測特異性、靈敏度以及范圍得以提高[5]。

4 結(jié)語

綜上所述，本文對多重PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用與展望進(jìn)行了探討與論述，可觀察出該項(xiàng)技術(shù)相比于一般PCR技術(shù)的優(yōu)勢所在。因此需給予多重PCR技術(shù)足夠的重視，探索其更多的發(fā)展空間與發(fā)展?jié)摿Γ蛊淠軌蛟谧顑?yōu)環(huán)境下實(shí)現(xiàn)充分的利用，從而高效率、高質(zhì)量地完成系列檢測任務(wù)，并較大程度的降低檢測 成本。