牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍研究進(jìn)展

李麗萍，戴雁峰，2

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古福瑞錦牧業(yè)有限公司，呼和浩特 010105）

近年來，卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)為眾多有生育欲望的女性提供新途徑的同時(shí)，也有效促進(jìn)了畜牧業(yè)的高速發(fā)展。相比于先前的慢速冷凍法，現(xiàn)如今廣泛應(yīng)用的玻璃化冷凍法使細(xì)胞的冷凍技術(shù)更加成熟。但在玻璃化冷凍的過程中，由于超低溫及高濃度的冷凍劑所帶來的物理、化學(xué)損傷對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器及各部分結(jié)構(gòu)造成不可逆的損害，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的發(fā)育潛能及表觀遺傳損傷。本文探討了玻璃化冷凍對(duì)牛卵母細(xì)胞的損傷以及目前常用的改善方法，以期降低牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍帶來的損傷。

1 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍研究發(fā)展概況

卵母細(xì)胞的冷凍保存為體外受精、核移植等技術(shù)的發(fā)展提供方便，還為瀕危物種提供了一種全新的繁殖途徑。同時(shí)，人卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的開展、實(shí)施也解決了凍存胚胎帶來的倫理問題。

1977年，Whittinham［1］首次將小鼠卵母細(xì)胞取出后進(jìn)行體外凍存，獲得了健康的子代。玻璃化冷凍法主要是利用冷凍液經(jīng)過迅速冷卻，使細(xì)胞直接形成為不規(guī)則的形態(tài)，此方法能夠維持細(xì)胞正常的離子、分子等的分布。

玻璃化冷凍技術(shù)在人類生殖保護(hù)及畜牧繁殖領(lǐng)域較為成熟。但是，各項(xiàng)研究表明，不同卵母細(xì)胞冷凍后的發(fā)育潛能區(qū)別較大。由于卵母細(xì)胞為單細(xì)胞、表面積與體積之比大、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，其在冷凍復(fù)蘇過程中困難重重。

關(guān)于人類和其他哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞凍存的研究表明，冷凍造成的極端環(huán)境會(huì)對(duì)參與調(diào)控的DNA結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期、線粒體穩(wěn)態(tài)、產(chǎn)生能量的基因及蛋白的表達(dá)以及透明帶、肌動(dòng)蛋白絲、紡錘體、線粒體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和維持鈣穩(wěn)態(tài)、皮質(zhì)顆粒的誘導(dǎo)和釋放等細(xì)胞功能均產(chǎn)生負(fù)面影響。

2 目前常用的玻璃化冷凍方法

2.1 開放式拉長(zhǎng)管（Open pulled straw，OPS）

OPS是一種目前應(yīng)用廣泛的冷凍方法，這種方法解凍后的卵細(xì)胞具有更高的受精率。通過虹吸作用可以將加入冷凍液的卵母細(xì)胞吸入加熱拉制而成的OPS管內(nèi)，然后直接置于超低溫的液氮內(nèi)。解凍方法為直接將OPS管浸泡在38℃解凍液內(nèi)，可以快速解凍釋放卵細(xì)胞。這種方法冷凍和解凍速度極快，能夠有效降低卵母細(xì)胞的損傷，使用OPS法凍存牛卵母細(xì)胞，相比于新鮮胚胎存活率雖略有下降，但胚胎率仍高達(dá)25%［2］。

2.2 玻璃微管（Glass micropipette，GMP）

該方法是由毛細(xì)玻璃管加熱拉制而成的，又稱為毛細(xì)玻璃管法。Kong等［3］最早是在胚胎上應(yīng)用GMP法得到了較理想的結(jié)果。與OPS相比，GMP熱傳遞效果更好，且可以避免解凍時(shí)管漂浮的問題，但缺點(diǎn)是易造成細(xì)胞的丟失［4］。許衛(wèi)華等［5］研究表明，GMP在一定程度上減少了冷凍所帶來的細(xì)胞損傷。

2.3 冷凍環(huán)法（Cryoloop）

Cryoloop以尼龍環(huán)作為載體，冷凍時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至薄膜上，后置于液氮中冷凍保存。Lane等［6］試驗(yàn)表明，使用該方法的囊胚率高達(dá)54.2%。Gasparri?ni等［7］利用該方式凍存水牛的卵母細(xì)胞，解凍后的細(xì)胞卵裂率高達(dá)45%，并獲得了體外成熟的牛囊胚胎。相較于OPS法，它的降溫速度更快，有利于減少冷凍所帶來的卵母細(xì)胞損傷。

3 冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的損傷

玻璃化冷凍在各類卵母細(xì)胞的凍存過程中應(yīng)用普遍，但是在冷凍過程中，對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生的損傷是無法規(guī)避的。牛卵母細(xì)胞對(duì)于降溫極為敏感，冷凍保護(hù)劑的化學(xué)毒性以及解凍過程中滲透壓的變化等都對(duì)卵母細(xì)胞造成損傷。

3.1 對(duì)卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的損傷

卵母細(xì)胞是單細(xì)胞，細(xì)胞的表面積與體積之比大，冷凍劑易滲入卵細(xì)胞內(nèi)對(duì)其造成物理性的損傷。在凍存過程中，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。另外，具有毒害作用的冷凍液在穿過細(xì)胞膜的過程中也會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

透明帶是保證卵母細(xì)胞正常受精的重要結(jié)構(gòu)。冷凍過程中，細(xì)胞的皺縮和變形會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的提前釋放，發(fā)生透明帶反應(yīng)。另外，冷凍會(huì)使透明帶變硬，這些都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞卵裂率、囊胚率等下降以及多精入卵率的上升［8］。

3.2 對(duì)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激上的損傷

冷凍后的卵母細(xì)胞的細(xì)胞器都會(huì)受到損傷，首先是線粒體的密度降低，嵴出現(xiàn)泡狀，但在復(fù)蘇后泡狀化會(huì)消失。因此，線粒體的損傷會(huì)影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育但不致死。其次，細(xì)胞核中的核纖層會(huì)被損壞，這就使基因表達(dá)受到影響。

Cheiler等［9］在復(fù)蘇的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了低密度的小泡，這表明在凍存過程中細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了損傷。另外，細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)胞器如線粒體、細(xì)胞骨架等也會(huì)受到損傷。

微管可形成紡錘體，其在細(xì)胞分裂時(shí)牽引染色體移向細(xì)胞兩極。超低溫會(huì)導(dǎo)致微管發(fā)生解聚，導(dǎo)致紡錘體形態(tài)不穩(wěn)定［10］。有研究表明，冷凍后會(huì)出現(xiàn)紡錘體退化、畸形等現(xiàn)象，且解凍后不能恢復(fù)，這導(dǎo)致染色體無法準(zhǔn)確的移向細(xì)胞兩極［11］。

3.3 對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育上的損傷

相對(duì)于技術(shù)成熟的胚胎冷凍而言，卵母細(xì)胞凍存技術(shù)還需要進(jìn)一步的探討。卵母細(xì)胞為單細(xì)胞，表面積與體積之比大，且細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)低溫更敏感等種種因素致使卵母細(xì)胞的凍存難度加大。卵母細(xì)胞在冷凍解凍的過程中，經(jīng)歷的高濃度冷凍液的毒害作用以及超低溫都會(huì)影響細(xì)胞的發(fā)育潛能。

3.4 對(duì)卵母細(xì)胞表觀遺傳上的損傷

作為表觀遺傳的重要表達(dá)方式，DNA甲基化可以通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶5'碳位連接一個(gè)甲基基團(tuán)，在卵母細(xì)胞的凍存過程中DNA甲基化表達(dá)模式會(huì)發(fā)生系列的變化，進(jìn)而調(diào)控復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育及子代表型。

研究發(fā)現(xiàn)，冷凍后的小鼠卵母細(xì)胞中全基因組DNA甲基化水平明顯降低，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的發(fā)育能力降低［12］。張培培等［13］分別對(duì)新鮮和玻璃化冷凍的牛卵母細(xì)胞的全基因組甲基化水平分析，結(jié)果表明冷凍并不會(huì)對(duì)GV期牛卵母細(xì)胞的甲基化水平產(chǎn)生影響，但是對(duì)解凍后的GV期細(xì)胞體外成熟至MⅡ期后進(jìn)行全基因組的甲基化水平分析時(shí)發(fā)現(xiàn)冷凍后牛卵母細(xì)胞甲基化水平顯著降低，從而影響了牛卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

4 冷凍保存技術(shù)的改善

4.1 卵母細(xì)胞注射調(diào)控手段

葉酸受體4（Juno蛋白）。Bianchi等［14］發(fā)現(xiàn)Juno是受精過程中的關(guān)鍵蛋白。郝彤［15］通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)及顯微注射技術(shù)，將Juno mRNA注射到卵母細(xì)胞中，進(jìn)一步探討了在玻璃化冷凍過程中，Juno蛋白對(duì)牛卵母細(xì)胞的影響機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，向牛卵母細(xì)胞中注射200 pg Juno mRNA時(shí)可顯著增強(qiáng)卵母細(xì)胞受精率、卵裂率和囊胚率等，這為玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞提供了新的技術(shù)手段。

4.2 凍存液成分添加抗凍保護(hù)劑

在玻璃化凍存過程中，卵母細(xì)胞可能會(huì)受到不可逆的損傷，無法修復(fù)，因此在牛卵母細(xì)胞凍存液中添加抗凍保護(hù)劑以防止凍存過程中細(xì)胞損傷是改善牛卵母細(xì)胞凍存體系的重要理論來源。

4.2.1 細(xì)胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）CB作為一種微絲穩(wěn)定劑，可以增加細(xì)胞骨架的彈性，緩解凍存導(dǎo)致的細(xì)胞損傷［16］。郭娟等［17］發(fā)現(xiàn)添加20μg/mL CB可以有效地改善牛卵母細(xì)胞的冷凍效果。Zhou等［18］發(fā)現(xiàn)冷凍前添加CB可以通過介導(dǎo)牛卵母細(xì)胞微絲的穩(wěn)定性促進(jìn)牛卵母細(xì)胞凍存效果，與王彩玲［19］、卞桂華等［20］研究結(jié)果一致。但郭娟［17］、Sripunya等［21］、Liang等［22］及Yamada等［23］的研究指出CB對(duì)牛卵母細(xì)胞的凍存保護(hù)效果并不適應(yīng)于未成熟的牛卵母細(xì)胞，其具體機(jī)制及差異有待深入研究。

4.2.2 紫杉醇（Taxol）紫杉醇能夠阻止微管的解聚，使得細(xì)胞內(nèi)微管二聚體的結(jié)合更加緊密，在冷凍的過程中能夠避免超低溫所帶來的微管損傷［18］。Park等［24］在對(duì)小鼠卵母細(xì)胞冷凍的研究中首次發(fā)現(xiàn)了紫杉醇對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的保護(hù)作用；張家新等［25］發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理雖然不能使綿羊卵母細(xì)胞存活率有所提升，但是0.5μmol/L紫杉醇處理后的綿羊卵母細(xì)胞囊胚率得到了有效改善。

Shayegh等［26］發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理對(duì)牛卵丘復(fù)合體的凍存沒有顯著的促進(jìn)作用，但Morató等［27］在玻璃化冷凍前用紫杉醇處理牛卵母細(xì)胞，結(jié)果表明在冷凍液中加入1μmol/L紫杉醇顯著增強(qiáng)了牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。與此同時(shí)，Morató等［28］同樣發(fā)現(xiàn)冷凍過程中添加紫杉醇可以有效地維持牛卵母細(xì)胞的紡錘體的形態(tài)，與Pitchayapipatkul等［29］研究結(jié)果一致。

4.2.3 抗冷凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）AFP最初是在深海魚中提取的一種蛋白類物質(zhì)，能夠有效地抑制冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，復(fù)蘇回溫過程中，該蛋白類物質(zhì)又進(jìn)入失活狀態(tài)［30］。目前已鑒定出的AFP有5種，分別為抗凍糖蛋白（Antifreeze glycoprotein）、AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ。Knight等［31］首次發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的凍存過程中添加AFP可以有效地保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而減少冷凍過程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成的損害，而且添加AFP的保護(hù)效果已經(jīng)在斑馬魚、山羊、猩猩、老鼠、兔子、水牛等生殖細(xì)胞、胚胎的冷凍過程中得到證實(shí)［32］。

Liang等［33］發(fā)現(xiàn)冷凍過程中添加抗凍糖蛋白可以有效地抑制因冷凍過程導(dǎo)致的活性氧積累、DNA斷裂、細(xì)胞自噬、肌動(dòng)蛋白損傷等現(xiàn)象，而且抗凍糖蛋白的添加可以有效地維持牛卵母細(xì)胞內(nèi)的紡錘體組裝、染色體排列及線粒體活性水平，從而顯著提高牛卵母細(xì)胞的存活率，而且體外受精后牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能得到有效地改善。

王勇杰等［34］分別在牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)液中添加了不同濃度的AFPⅢ。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于GV期卵母細(xì)胞，添加500 ng/mL AFPⅢ，可以有效地促進(jìn)牛卵母細(xì)胞復(fù)蘇后的發(fā)育潛能。而在MⅡ牛卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍過程中，添加750 ng/mL AFPⅢ可以有效地促進(jìn)牛卵母細(xì)胞復(fù)蘇后的發(fā)育潛能，這表明添加AFPⅢ可以有效地降低細(xì)胞冷凍過程中卵母細(xì)胞的損傷。

4.2.4 釕紅（Ruthenium red，RR）玻璃化冷凍后，卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體受到損害，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，RR能夠調(diào)控Ca2+水平從而改善卵母細(xì)胞解凍后的損傷。王娜等［35］通過往牛卵母細(xì)胞冷凍液中加入不同濃度的RR，檢測(cè)線粒體內(nèi)的Ca2+水平及解凍后的卵裂率、受精率、囊胚率、發(fā)育等情況，結(jié)果表明冷凍液中添加2μmol/L的RR能夠顯著改善冷凍對(duì)細(xì)胞的創(chuàng)傷，抑制細(xì)胞的凋亡，可以有效地促進(jìn)牛卵母細(xì)胞冷凍效果。

5 結(jié)語(yǔ)

玻璃化冷凍技術(shù)雖然已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于牛卵母細(xì)胞的長(zhǎng)期保存，但目前主要集中于對(duì)MⅡ和GV期細(xì)胞卵母細(xì)胞的研究。冷凍過程中不可避免的會(huì)發(fā)生細(xì)胞結(jié)構(gòu)、氧化應(yīng)激上的損傷。因此需要通過各種不同的調(diào)控方式來改善卵母細(xì)胞的凍存，主要包括對(duì)卵母細(xì)胞本身蛋白水平的調(diào)控以及凍存液成分的改善等手段來有效改善卵母細(xì)胞的冷凍保存方法。