轉(zhuǎn)錄因子OsMADS25提高水稻對低溫的耐受性

閆凌月，張豪健，鄭雨晴，叢韞起，劉次桃，樊帆，鄭鋮，袁貴龍，潘根，袁定陽，段美娟

研究報告

轉(zhuǎn)錄因子OsMADS25提高水稻對低溫的耐受性

閆凌月1，張豪健1，鄭雨晴1，叢韞起1，劉次桃1，樊帆1，鄭鋮1，袁貴龍2，潘根3，袁定陽2，段美娟1

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，水稻逆境生物學湖南省重點實驗室，長沙 410128 2. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點實驗室，長沙 410125 3. 中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410205

低溫冷害是影響水稻高產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)境因素，鑒定和克隆具有重要應用價值的耐低溫基因并培育耐低溫新品種對于保障糧食安全具有重要意義。MADS轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號途徑中扮演著重要的角色。本研究利用qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)受低溫和脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導表達上調(diào)，預示可能參與ABA依賴的逆境信號途徑。進一步構(gòu)建了水稻的過表達載體pCambia1300-221--Flag，利用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法將其導入水稻品種中花11 (ZH11)，選取兩個表達量高的純合株系進行表型鑒定。結(jié)果表明，過表達株系顯著提高了水稻苗期對低溫的耐受性以及對ABA的敏感性。利用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidine, DAB)和氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)組織化學染色結(jié)果表明：低溫處理后，過表達株系比野生型ZH11染色淺，表明過表達株系在低溫脅迫下積累的活性氧(reactive oxygen species, ROS)相對較少，增強了對低溫的耐受性。綜合結(jié)果表明，低溫逆境下響應ABA信號，通過提高水稻對ROS的清除能力，避免水稻受到低溫傷害。

水稻；；脫落酸；活性氧；耐低溫

水稻(L.)是最主要糧食作物，世界上有一半以上的人口以水稻為主食[1]。相比其他主糧作物如小麥(L.)、大麥(L.)等，水稻對低溫更加敏感[2]。世界上約有24個國家如中國、日本、朝鮮等遭遇過低溫冷害問題[3]。低溫對水稻的影響主要發(fā)生在幼苗期和生殖生長期。例如在我國的華南和長江中下游雙季稻區(qū)早稻苗期遇到“倒春寒”，晚稻抽穗揚花期遇到“寒露風”低溫災害氣候，導致水稻大幅減產(chǎn)[4～7]。低溫災害使我國每年糧食減產(chǎn)30～50億公斤[8]。低溫嚴重制約水稻的產(chǎn)量，因此挖掘耐低溫新基因及培育耐低溫新品種是水稻育種的重要研究方向。

植物耐受低溫脅迫是一個復雜的遺傳性狀，受多個基因/數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)控制。與其他農(nóng)藝性狀相比，水稻低溫耐受性的遺傳研究進展緩慢，在過去幾十年內(nèi)，通過正向遺傳學方法鑒定出的耐低溫基因相對有限，包括8個QTL定位的基因和，2個由全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)定位的基因和。編碼一個富含甘氨酸(GRP)的保守結(jié)構(gòu)域，第17位氨基酸為賴氨酸(Lys)基因型表現(xiàn)為低溫下種子萌發(fā)率增強；而第17位氨基酸為組氨酸(His)基因型則表現(xiàn)為穗期耐低溫[9,10]。編碼G蛋白信號調(diào)節(jié)因子，其與G蛋白α亞基RGA1互作，促進Ca2+流入細胞內(nèi)，并增強G蛋白的GTP酶活性，進而增強水稻對低溫的耐受性[11]。過表達提高水稻對低溫的耐受性[12]。第99位氨基酸為異亮氨酸(Ile)時，對提高水稻苗期耐低溫起重要作用[13]。編碼氧化酶，催化生物活性的茉莉?；?L-異亮氨酸(JA-Ile)轉(zhuǎn)化為無活性形式的12-羥基-JA-Ile (12OH- JA-Ile)，并通過調(diào)節(jié)茉莉酸(jasmonic acid, JA)含量來調(diào)控水稻對低溫的耐受性[14]。編碼酪蛋白激酶I (casein kinase I)，提高低溫下水稻的生長速率及產(chǎn)量[15]。編碼一個含有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白，其與E3泛素連接酶Skp1互作，參與泛素-蛋白酶體的低溫信號傳導途徑[16]。編碼一個保守的富亮氨酸受體激酶LRR-RLK (leucine-rich repeat receptor- like kinase)，其與ATP合成酶的β亞基AtpB互作，并在低溫下復合體通過影響ATP合成酶的活性，從而影響水稻灌漿期的能量供應，進而提高水稻抽穗期對低溫的耐受性[3]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子，與另一個bZIP蛋白bZIP71互作來調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)和可溶性糖水平，從而提高水稻苗期和抽穗期對低溫的耐受性[10,17]。在343位的核苷酸為G時，表現(xiàn)出在苗期和抽穗期都耐低溫[18]。

植物響應低溫逆境信號的基因可分為有兩大類：第一類是功能基因，其編碼產(chǎn)物在植物受逆境脅迫時直接起保護作用，例如滲透保護劑合成酶基因、抗氧化酶類等；第二類是調(diào)節(jié)基因，其編碼產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)功能基因的協(xié)同表達，從而使植物避免受到逆境的傷害，例如蛋白激酶類和轉(zhuǎn)錄因子[19]。一個轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一類相關(guān)性狀的很多基因，從而有效改變植物的相關(guān)特性。因此，轉(zhuǎn)錄因子往往是植物耐受逆境(包括低溫)等的主效基因。因此，從一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子入手，可促使多個脅迫應答基因發(fā)揮作用。

MADS轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與激素和非生物逆境脅迫應答。例如擬南芥()開花時間基因的突變提高植物對低溫的耐受性[20]；擬南芥通過調(diào)節(jié)ABA信號基因的表達來調(diào)節(jié)植物對滲透脅迫的耐受性[21]。小麥(L.)受條銹菌感染后表達上調(diào)[22]。水稻負調(diào)節(jié)水稻對病原體的抗性和對干旱的耐受性[23]，而參與調(diào)節(jié)水稻對高溫的敏感性[24]。最近研究表明，通過影響硝酸鹽的積累以及調(diào)節(jié)生長素的方式調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育，進而提高水稻對鹽的耐受性[25,27]。然而是否響應低溫逆境脅迫仍不清楚。為了研究是否響應低溫逆境信號途徑，本文探究了過表達轉(zhuǎn)基因株系對逆境關(guān)鍵激素ABA的響應，以及轉(zhuǎn)基因株系在低溫下的存活率、下游調(diào)控基因和清除ROS的能力，揭示響應水稻低溫脅迫的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻粳稻品種ZH11和日本晴(Nipponbare)，根癌農(nóng)桿菌()菌株AGL0、大腸桿菌()菌株DH5α由湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院湖南省逆境生物學重點實驗和湖南雜交水稻研究中心提供。pCambia1300-221-Flag質(zhì)粒由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所儲成才研究員惠贈。高保真DNA聚合酶(KOD FX酶)購于TOYOBO(日本)公司；酶、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶等購于TaKaRa (日本)公司；DEPC以及組培試劑購于Sigma (美國)公司；RNA提取Trizol購于Invitrogen (美國)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TOYOBO (日本)公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購于TIANGEN (中國)公司；3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidine, DAB)和氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)購于Solarbio (中國)生物公司。引物合成和測序由擎科生物技術(shù)有限公司(中國)完成。

1.2 OsMADS25過表達載體的構(gòu)建

提取日本晴兩周齡幼苗總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，以引物F：5?- CTAGATGGGGAGAGGGAAGATTGC-3?和R：5?-ACGCTTCATCTTCAACTTCT-TTTTGACTCA-3? (下劃線為酶切位點)，高保真酶KOD FX (TOYOBO公司，日本)進行PCR擴增，獲得() CDS序列。用I和I酶切PCR純化產(chǎn)物和雙元表達載體pCambia1300-221-Flag質(zhì)粒(構(gòu)建過程如圖1所示)，利用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α體內(nèi)，提取質(zhì)粒。經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒由美國Invitrogen公司測序。將測序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于根癌農(nóng)桿菌，成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌的菌落再浸染ZH11的愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選獲得過表達的陽性轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 OsMADS25過表達載體構(gòu)建示意圖

1.3 逆境誘導表達譜分析

對兩周齡的ZH11分別進行低溫逆境(4℃)和ABA (100 μmol/L)處理，以正常條件為對照，分別于0、0.5、3、6、12、24 h收集根和苗，按照美國Invitrogen公司RNA提取Trizol說明書提取總RNA，按照日本TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以()為內(nèi)參，qRT-PCR檢測不同時間點和不同部位在RNA水平的表達量。引物序列見表1。

1.4 轉(zhuǎn)基因株系低溫耐受性檢測

轉(zhuǎn)基因株系及野生型ZH11種子放入鼓風干燥箱箱(42℃，7 d)以破除休眠，放入37℃恒溫箱浸種2 d，露白后的種子移至剪孔型的PCR板中，用IRRI 營養(yǎng)液(International Rice Research Institute Protocol, http://irri.org)培養(yǎng)至三葉一心時期，在光照培養(yǎng)箱(Percival公司，美國)進行低溫(4℃)處理，70%相對濕度、14 h白天/10 h夜晚。低溫處理3 d后，恢復至正常溫度(28±2℃)，統(tǒng)計成活率。每個處理120棵苗，3個平行重復。利用SAS軟件(http://www.sas.com/)進行統(tǒng)計分析。

1.5 DAB和NBT染色

DAB和NBT染色分別用于檢測過表達株系及野生型ZH11對照在低溫處理后植株中雙氧水(H2O2)和超氧陰離子(O2–)含量。

DAB染色采用Solarbio生物公司DAB濃縮型試劑盒。NBT染色：稱取100 mg NBT加入到100 mL 10 mmol/L的磷酸緩沖液(0.2 mol/L KH2PO45 mL、0.2 mol/L NaOH 4.52 mL、pH=7.8)中，充分攪拌至NBT完全溶解。兩者均過夜染色，染色過程中避光，95%酒精清洗葉片，并在沸水中煮10 min，以至葉片褪色，拍照。

1.6 ABA敏感性檢測

過表達株系及野生型ZH11種子于37℃浸種2 d，將露白的種子放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，分別用含0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L ABA的水溶液處理10 d，測量苗的長度。實驗在人工氣候室進行(28℃、70%相對濕度，14 h白天/10 h夜間光周期)。每個平皿30棵苗，每個處理3個平行重復，用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

1.7 OsMADS25下游基因的檢測

提取兩周齡過表達株系及野生型ZH11幼苗的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，qRT-PCR檢測過表達株系和野生型ZH11中低溫響應基因()、()和()的相對表達量，以()為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMADS25受低溫和ABA誘導

對三葉一心時期(約兩周齡)的野生型ZH11進行低溫(4℃)逆境和逆境激素ABA處理，為區(qū)別是否響應光周期，本研究設(shè)置了正常培養(yǎng)條件作為對照。結(jié)果顯示：經(jīng)ABA處理，野生型ZH11根和地上部分的表達量上調(diào)；在根中僅0.5 h就表現(xiàn)出上調(diào)，在6 h表達量達到峰值(圖2)；在地上部分，在6 h表達上調(diào)，在12 h表達量達峰值。經(jīng)低溫處理，的表達量僅在根中12～24 h上調(diào)(圖2)。根是植物最先感知和響應逆境的部位，經(jīng)ABA處理后，表達量在根中增加的速度比地上部分要快(圖2)。結(jié)果表明，受低溫和ABA誘導表達上調(diào)，預示著可能參與響應ABA依賴的低溫信號途徑。

2.2 OsMADS25提高水稻對低溫的耐受性

受低溫誘導表明它可能參與低溫逆境信號。為了鑒定在水稻中是否參與對低溫耐受性的調(diào)節(jié)，本研究通過對過量表達的T3純合株系中相對表達量的檢測，選取相對表達量在轉(zhuǎn)錄水平上表達量高且差異顯著的兩個純合株系OE-1和OE-3進行表型鑒定(圖3 B)。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，過表達株系OE-1和OE-3的成活率分別比野生型ZH11高53%和38% (圖3：A，C)。過表達株系極大的提高了水稻在低溫下的成活率；且相對表達量高的株系OE-1的成活率顯著高于OE-3 (圖3：B，C)，表明對低溫的耐受性與相對表達量呈正相關(guān)。

2.3 OsMADS25提高水稻對ABA的敏感性

正調(diào)控水稻對低溫的耐受性，且受ABA誘導表達上調(diào)，表明可能參與ABA依賴的低溫信號途徑。為探究是否參與ABA信號，本研究對過表達株系(OE-1和OE-3)及野生型ZH11進行ABA敏感性測試。結(jié)果表明：在5 μmol/L和10 μmol/L的ABA處理后，過表達株系都表現(xiàn)為苗長都顯著比ZH11矮14%和6%以上(圖4：C～F)；而過表達株系與野生型ZH11在正常條件下無顯著差異(圖4：A，B)。過表達株系幼苗的生長受ABA抑制比野生型ZH11更強，這表明提高水稻對ABA的敏感性，預示了可能參與ABA依賴的低溫逆境信號。

2.4 OsMADS25上調(diào)低溫響應相關(guān)基因

低溫逆境下，植物通過提高抵御滲透脅迫和清除ROS的能力來應對逆境脅迫[28]。本研究利用qRT-PCR檢測了在低溫逆境中參與滲透脅迫、清除ROS的相關(guān)基因在過表達轉(zhuǎn)基因株系的表達情況。結(jié)果表明，和表達上調(diào)(圖5)。影響生長素運輸、合成和信號傳導，正調(diào)控水稻在營養(yǎng)生長期的低溫耐受能力[15]。影響滲透物質(zhì)和ROS的積累，正向調(diào)控水稻對低溫脅迫的耐受性[29]。過表達株系，提高水稻海藻糖的含量，調(diào)節(jié)滲透壓，進而使水稻對多種脅迫產(chǎn)生抗性[30～32]。這些結(jié)果表明：可能通過上調(diào)和的表達，進而提高水稻耐低溫的能力。

2.5 OsMADS25提高水稻對活性氧的清除能力

上調(diào)的表達(圖5)，而在逆境中發(fā)揮清除ROS的功能。另外，Xu等[26]報道通過激活下游基因谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶4 (glutathione S–transferase 4,)和的表達，進而提高水稻在鹽處理下清除ROS以及提高應對滲透脅迫的能力。那么參與低溫逆境是否與耐鹽有相似的生理機制？為了進一步探討參與低溫逆境的生理機制，本研究對轉(zhuǎn)基因株系及野生型ZH11對照在低溫(4℃)處理6 h后，進行DAB和NBT染色，檢測葉片中H2O2及O2–的含量。結(jié)果表明：野生型ZH11的葉片染色深，而轉(zhuǎn)基因株系OE-1、OE-3的葉片染色淺(圖6)，說明轉(zhuǎn)基因株系中積累的活性氧H2O2及O2–的含量比ZH11少，由此說明可能通過提高水稻在低溫下對ROS的清除能力進而提高對低溫的耐受性。

圖2 野生型ZH11中OsMADS25受低溫和ABA誘導表達上調(diào)

對照：兩周齡的野生型ZH11在溫室正常條件下培養(yǎng)；低溫：兩周齡的野生型ZH11在4℃光照培養(yǎng)箱處理；ABA：兩周齡的野生型ZH11用含100 μmol/L ABA的IRRI營養(yǎng)液處理。

圖3 OsMADS25提高水稻對低溫的耐受性

A：低溫(4℃)處理過表達株系及野生型對照ZH11。OE-1、OE-3為過表達T3代的兩個純合株系；比例尺：5 cm。B：過表達株系中在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量。C：轉(zhuǎn)基因株系成活率統(tǒng)計。統(tǒng)計分析采用SNK-q單因素多重比較分析，不同的字母表示具有顯著差異(<0.01)。

圖4 OsMADS25過表達株系幼苗的生長受ABA抑制比野生型ZH11更強

A，B：0 μmol/L ABA處理過表達株系與野生型ZH11并在10 d后統(tǒng)計苗長；C，D：5 μmol/L ABA處理過表達株系與野生型ZH11并在 10 d后統(tǒng)計苗長；E，F(xiàn)：10 μmol/L ABA處理過表達株系與野生型ZH11并在 10 d后統(tǒng)計苗長。OE-1、OE-3為過表達T3代的兩個純合株系；統(tǒng)計分析采用SNK-q單因素多重比較分析，不同的字母表示具有顯著差異(<0.01)。

3 討論

()在水稻4號染色體13.6 Mb位置上，與Schl?ppi等[5]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)定位的水稻微核心種質(zhì)資源群體(Minicore)苗期耐低溫QTL的位置重疊。過表達提高了水稻對低溫的耐受性，說明可能是耐低溫QTL的主效基因。

過表達轉(zhuǎn)基因的T3代純合株系OE-1的表達量高于OE-3，對低溫的耐受性也是OE-1高于株系OE-3，這表明正調(diào)控水稻對低溫的耐受性。受低溫和ABA誘導表達上調(diào)(圖2)，轉(zhuǎn)基因株系提高了水稻對ABA的敏感性(圖4)，下游調(diào)控基因、受ABA誘導表達上調(diào)[29,31]。這些結(jié)果表明：參與ABA依賴的低溫逆境信號。低溫處理后，轉(zhuǎn)基因株系NBT和DAB染色淺，ROS積累少，對低溫耐受性強。Xu等[26]報道通過提高水稻在鹽逆境下對ROS的清除能力，從而提高水稻的耐鹽性。另外，的另一下游調(diào)控基因，在逆境具有調(diào)節(jié)滲透壓的作用[30～32]。這說明在低溫逆境下可能通過調(diào)控的表達，進而調(diào)節(jié)滲透壓，提高水稻對低溫的耐受性。這表明在耐鹽和耐低溫有相似的生理機制。綜上所述，低溫逆境時，轉(zhuǎn)錄因子響應ABA信號，通過調(diào)節(jié)的表達，進面提高水稻對ROS的清除能力；同時，通過調(diào)節(jié)的表達，進而調(diào)節(jié)滲透壓，降低低溫對水稻的傷害(圖7)。是一個耐低溫新的基因，其功能的鑒定對于豐富水稻耐低溫基因資源，以及培育耐低溫水稻新品種具有一定的意義。

圖5 OsMADS25過表達株系提高耐低溫相關(guān)基因的表達

ZH11為野生型對照；OE-1、OE-3為過表達T3代的兩個純合株系；統(tǒng)計方法為-test；**<0.01，差異極顯著。

圖6 OsMADS25提高水稻對ROS的清除能力

DAB染色表示植物在低溫處理后H2O2的積累情況，NBT染色表示植物在低溫處理后O2–的積累情況。ZH11為野生型對照；OE-1，OE-3為過表達T3代的兩個純合株系；比例尺：5 mm。

圖7 OsMADS25提高水稻耐低溫的可能機制

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Transcription factor OsMADS25 improves rice tolerance to cold stress

Lingyue Yan1, Haojian Zhang1, Yuqing Zheng1, Yunqi Cong1, Citao Liu1, Fan Fan1, Cheng Zheng1, Guilong Yuan2, Gen Pan3, Dingyang Yuan2, Meijuan Duan1

Cold stress is the limiting factor of rice growth and production, and it is important to clone cold stress tolerant genes and cultivate cold tolerance rice varieties. The MADS transcription factors play an important role in abiotic stress signaling in rice. This study showed thatwas up-regulated by low temperature and abscisic acid (ABA), suggesting thatmay be involved in ABA-dependent signaling. Theoverexpression vector, pCambia1300-221--Flag, was constructed and introduced into the rice variety Zhonghua 11 (ZH11) through-mediated genetic transformation. Two homozygous lines with high expression levels were selected for phenotypic identification.overexpression lines show significantly improved cold stress tolerance and the sensitivity to ABA at the seedling stage of rice.Reactive oxygen species (ROS) was detected by diaminobenzidine (DAB) staining and nitroblue tetrazolium (NBT) staining. After treatment with cold stress, little ROS accumulation was observed inoverexpression lines compared to wild-type ZH11. In conclusion,plays a role in scavenging reactive oxygen species (ROS) and could improve rice tolerance to cold stress involved in ABA-dependent pathway.

rice (L.);; abscisic acid (ABA); reactive oxygen species(ROS); cold tolerance

2021-06-20;

2021-08-21

湖南省科技重大專項(編號：2018NK1010)，湖南省科技人才支持項目(編號：2019TJ-Q08)，湖南農(nóng)業(yè)大學人才引進啟動基金(編號：20154/5407419002)，雜交水稻國家重點實驗室(湖南雜交水稻研究中心)開放課題(編號：2020KF05)和湖南省自然科學基金青年基金項目(編號：2019JJ50714)資助[Supported by the Hunan Science and Technology Major Project (No.2018NK1010), the Hunan Science and Technology Talents Support Project (No.2019TJ-Q08), the Research Initiation Fund of Hunan Agricultural University (No.20154/5407419002), the Open Research Fund of the State Key Laboratory of Hybrid Rice, Hybrid Rice Research Center (No.2020KF05) and the Hunan Province Natural Science Fund (No. 2019JJ50714)]

閆凌月，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：作物遺傳育種。E-mail: yanlingyue0203@163.com

袁定陽，博士，研究員，研究方向：作物遺傳育種。E-mail: yuandingyang@hhrrc.ac.cn

段美娟，博士，研究員，研究方向：作物遺傳育種。E-mail: duanmeijuan@163.com

10.16288/j.yczz.21-217

2021/10/13 11:34:37

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20211012.2042.002.html

(責任編委: 儲成才)