三角帆蚌細(xì)胞周期蛋白基因篩選及其表達(dá)分析

馮上樂，李雪男，陳一格，劉瑞琦，白志毅，b，c，李文娟，b，c，*

(上海海洋大學(xué) a. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海201306)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)真瓣鰓目(Eulamellibranchia)蚌科(Unionidae)帆蚌屬，主要分布于中國長江下游廣大流域，是中國特有的淡水育珠蚌，占據(jù)重要的經(jīng)濟(jì)與戰(zhàn)略地位[1]。在三角帆蚌體外細(xì)胞培養(yǎng)研究中，游離細(xì)胞的增殖能力較低，活性較差[2-3]，限制了該領(lǐng)域細(xì)胞學(xué)方面的研究，至今細(xì)胞系的建立仍未突破。細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞分裂的內(nèi)在動(dòng)力因子，參與細(xì)胞的增殖、分化[4]。因此，探究細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞分裂過程中的作用對(duì)解決游離細(xì)胞增殖問題具有重要意義。

1983年，在海膽(Echinoidea)中發(fā)現(xiàn)周期蛋白，隨后在高等真核生物中數(shù)十種周期蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)，但在細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)換中，僅有A、B、C、D、E 5種周期蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。水生動(dòng)物中，對(duì)細(xì)胞周期蛋白基因A、B、E的研究集中于性腺發(fā)育過程，很多研究表明，在性腺發(fā)育過程中，這3種周期蛋白基因均存在高表達(dá)，且cyclinA、cyclinB隨著性腺發(fā)育表達(dá)量逐漸升高[6-8]。細(xì)胞周期蛋白A參與調(diào)控細(xì)胞周期S期和M期，Visudtiphole等[9]從斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)中克隆了cyclinA基因，并發(fā)現(xiàn)其在成體卵巢中表達(dá)水平顯著高于幼體。成熟促進(jìn)因子(mature promoting factor，MPF)是動(dòng)物卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中控制G2/M期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子，細(xì)胞周期蛋白B是MPF的主要成分，在海膽、斑節(jié)對(duì)蝦的卵母細(xì)胞，以及刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)、大黃魚(Larimichthyscrocea)卵巢中均大量表達(dá)，推測(cè)其與卵巢的發(fā)育密切相關(guān)[10-14]。細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D)參與調(diào)控細(xì)胞周期G1期，在水生生物中研究較少，對(duì)海膽的研究認(rèn)為cyclin D對(duì)其胚胎早期發(fā)育有重要作用[15]。細(xì)胞周期蛋白E能與周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)結(jié)合調(diào)節(jié)G1/S期的轉(zhuǎn)換，但其功能在水生動(dòng)物中研究較少。Kurokawa等[16]克隆了海膽cyclinE基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)海膽cyclin E氨基酸序列與爪蟾(Xenopuslaevis)、斑馬魚(Daniorerio)的cyclin E氨基酸序列高度相似。目前，cyclin基因在貝類中的研究較少。王桐等[17]在長牡蠣(Crassostreagigas)克隆得到cyclinB3基因，其表達(dá)量與性腺發(fā)育程度有關(guān)。劉佳敏等[18]克隆了三角帆蚌cyclinB基因，認(rèn)為其在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用，尚未見更深入的研究報(bào)道。

鑒于細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞增殖進(jìn)程中的重要作用，使用Illumina HiSeq 2000對(duì)三角帆蚌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，參考實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的不同時(shí)間外套膜插核的數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling，DGE)，進(jìn)行三角帆蚌細(xì)胞周期蛋白基因篩選，結(jié)合生物信息分析和分子生物學(xué)手段，對(duì)靶基因進(jìn)行初步驗(yàn)證，構(gòu)建了三角帆蚌不同性別與組織cyclins基因的表達(dá)譜，為以后的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用三角帆蚌取自武義偉民水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)基地，挑選體重、體型相似，健康的2齡三角帆蚌，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室中，日常投喂小球藻并充氧。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品選?。弘S機(jī)選取10只三角帆蚌，取其血淋巴、外套膜、性腺與內(nèi)臟團(tuán)分別置于滅菌的1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中速凍，-80 ℃保存。

熒光定量樣品選?。弘S機(jī)挑選15只雌蚌和15只雄蚌(三角帆蚌雌雄鑒別參考吳從迪等[19]的方法)，分別取閉殼肌、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、斧足、心臟、血液、鰓與性腺，用0.5% DEPC(Invitrogen，美國)水洗凈，置于滅菌1.5 mL離心管中并放入液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

1.2.1 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和Illumina測(cè)序、組裝

RNA提取方法參照Trizol?Reaget(Invitrogen，美國)的說明，RNA純度和濃度使用NANODROP 2000C(Thermo Fisher Scientific，美國)測(cè)定，RNA質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，cDNA文庫的構(gòu)建和Illumina HiSeq 2000測(cè)序在北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行，獲得的測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去除接頭、雜質(zhì)和去冗余處理，并經(jīng)Trinity軟件拼接和同源基因的聚類分析后，獲得unigene序列。

1.2.2 基因功能注釋與cyclins基因篩選

組裝得到的高質(zhì)量unigene序列分別與Nr (NCBI non-redundant protein sequences)、Nt (NCBI nucleotide sequences)、Pfam (Protein family)、KOG/COG(euKaryotic Ortholog Groups/Clusters of Orthologous Groups of proteins)、Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、GO(Gene Ontology)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)(E-value<10-5，E-value表示假陽性率，E-value越小越好)，得到unigene功能注釋信息。

以“cell cycle”和“cyclin”為關(guān)鍵詞在三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組庫中搜索，將篩選出的相關(guān)unigene進(jìn)行基因注釋，用pathway分析篩選出cyclins相關(guān)unigene。用NCBI網(wǎng)站的Blast功能將cyclins相關(guān)unigene與牡蠣等水生軟體動(dòng)物比對(duì)，選擇序列保守性高的unigene，結(jié)合不同插核時(shí)間三角帆蚌外套膜的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)分析(實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建)，篩選出三角帆蚌中與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的cyclins基因。

1.3 cyclins基因克隆和序列分析

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選得到cyclins基因序列，根據(jù)其保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物(引物設(shè)計(jì)要求退火溫度為55～60 ℃，GC含量為40%～60%)，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增模板選取三角帆蚌組織混合池cDNA。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa，日本)，與PMD19-T(TaKaRa，日本)連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α中。采用菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證的陽性菌液于生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析序列的開放閱讀框，使用NCBI Blast分析比對(duì)氨基酸序列。使用DNAMAN軟件比對(duì)克隆的三角帆蚌與GenBank中同源物種的cyclins核苷酸和氨基酸序列，預(yù)測(cè)序列保守性。使用String(http://string-db.org)進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)。

1.4 cyclins基因表達(dá)分析

取凍存的組織樣品用于RNA提取，RNA提取按照Trizol?Reaget(Invitrogen，美國)的操作說明進(jìn)行，RNA純度、濃度與質(zhì)量檢測(cè)與1.2.1節(jié)相同，反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)。根據(jù)克隆得到的cyclins基因CDS區(qū)序列，用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。以2×iQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)為熒光染料，選取EF1α為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，2×iQTMSYBR Green Supermix 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，基因表達(dá)水平用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS 24.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和組間多重比較，使用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行作圖分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組unigene組裝和功能注釋

數(shù)據(jù)拼接后得到257 457條unigene，總核苷酸數(shù)193 448 860 bp，平均長度為751 bp，N50為1 796 bp。將所有的unigene在NCBI的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr)進(jìn)行相似搜索(E值<10-5)。

將unigenes分別與Nr、Nt、Swissprot、KO、GO、和KOG、PfAM數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，成功注釋223 345條，注釋率為86.7%。Nr、Nt、Swissprot、KO、GO、KOG和PfAM數(shù)據(jù)庫分別注釋到的44 822、11 068、33 642、11 636、50 182、22 718和49 277條unigenes。

2.2 三角帆蚌細(xì)胞周期蛋白篩選結(jié)果

數(shù)據(jù)篩選結(jié)果表明，103條unigene與cyclins相關(guān)，64條unigene與cycle相關(guān)，130條unigene與CDK相關(guān)。將找到的103條cyclins相關(guān)unigene進(jìn)行基因注釋和pathway分析，從中篩選出10個(gè)cyclins相關(guān)unigene(表2)，結(jié)合這10個(gè)相關(guān)unigene的開放閱讀框與靶蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果，參考相關(guān)基因的文獻(xiàn)，篩選得到4個(gè)cyclins基因：cyclinA、cyclinB[18]、cyclinD2、cyclinE。

表2 三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組文庫篩選的cyclins相關(guān)unigene

2.3 cyclins基因克隆與分析

克隆得到的三角帆蚌cyclinA基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)長度為413 bp，分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，第3～81 aa構(gòu)成一個(gè)周期蛋白框(圖1)。與其他物種cyclin A的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖2)顯示，三角帆蚌cyclin A氨基酸序列與斑馬貽貝相似性最高，為84%；與美洲牡蠣和太平洋牡蠣的相似性為72%。String蛋白數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果表明，三角帆蚌的cyclin A蛋白與CDK1、CDK2、細(xì)胞分裂周期基因6(CDC)能發(fā)生相互作用。

黑色框內(nèi)為周期蛋白框。Black frame was the cyclin box.圖1 三角帆蚌cyclin A基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Predicted amino acid sequence of cyclin A gene in Hyriopsis cumingii

cyclin A氨基酸比對(duì)所用物種登錄號(hào)：斑馬貽貝，AAC35953.1；美洲牡蠣，XP_022320685.1；太平洋牡蠣，XP_034299932.1；蝦夷扇貝，XP_021364053.1；斑節(jié)對(duì)蝦，ACH72071.1；非洲爪蟾，NP_001081579.1；斑馬魚，AAH68323.2；長棘海星，XP_022085019.1。GenBank accession numbers of cyclin A: Dreissena polymorpha， AAC35953.1;Crassostrea virginica， XP_022320685.1; Crassostrea gigas， XP_034299932.1;Mizuhopecten yessoensis， XP_021364053.1;Penaeus monodon， ACH72071.1;Xenopus laevis， NP_001081579.1;Danio rerio， AAH68323.2;Acanthaster planci， XP_022085019.1.圖2 三角帆蚌與其他物種cyclin A氨基酸相似性序列比對(duì)Fig.2 Amino acid similarity alignment of cyclin A among Hyriopsis cumingii and other species

克隆得到的cyclinD2編碼的CDS區(qū)長度為501 bp，氨基酸序列分析表明第22～148 aa構(gòu)成了一個(gè)周期蛋白框(圖3)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖4)顯示，三角帆蚌cyclin D2氨基酸序列與美洲牡蠣、太平洋牡蠣相似性最高并聚為一支，相似性為77%，其次與蝦夷扇貝相似性較高，為76%。String蛋白數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)表明，cyclin D2與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)能發(fā)生相互作用。

黑色框內(nèi)為cyclin box。Black frame was the cyclin box.圖3 三角帆蚌cyclin D2基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.3 Predicted amino acid sequence of cyclin D2 gene in Hyriopsis cumingii

cyclin D2氨基酸比對(duì)所用物種登錄號(hào)：斑馬貽貝，AAM44813.1；美洲牡蠣，XP_022292709.1；太平洋牡蠣，XP_011430967.2；蝦夷扇貝，XP_021360132.1；非洲爪蟾，CAA61665.1；斑馬魚，NP_001082914.1；長棘海星，XP_022112210.1。GenBank accession numbers of cyclin D2: Dreissena polymorpha， AAM44813.1;Crassostrea virginica， XP_022292709.1;Crassostrea gigas， XP_011430967.2;Mizuhopecten yessoensis， XP_021360132.1;Xenopus laevis， CAA61665.1;Danio rerio， NP_001082914.1;Acanthaster planci， XP_022112210.1.圖4 三角帆蚌與其他物種cyclin D2氨基酸相似性序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence similarity alignment of cyclin D2 among Hyriopsis cumingii and other species

克隆得到的cyclinE基因編碼的CDS區(qū)長度為415 bp，由于其氨基酸序列較短(圖5)，通過NCBI對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析未得到結(jié)果。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖6)顯示，三角帆蚌cyclin E氨基酸序列與蝦夷扇貝序列相似性最高，為65%，其次，與美洲牡蠣和太平洋牡蠣相似性較高且聚為一支，相似性為60%。String蛋白數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示，cyclin E能在細(xì)胞周期調(diào)控中與CDK1、CDK2、CDK4相互作用。

圖5 三角帆蚌cyclin E基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.5 Predicted amino acid sequence of cyclin E gene in Hyriopsis cumingii

cyclin E氨基酸比對(duì)所用物種登錄號(hào)：美洲牡蠣，XP_022336414.1；太平洋牡蠣，XP_011433150.1；蝦夷扇貝，OWF54564.1；斑節(jié)對(duì)蝦，AGW23550.1；非洲爪蟾，CAA78370.1；斑馬魚，CAA58574.1；長棘海星，XP_022092193.1。GenBank accession numbers of cyclin E: Crassostrea virginica， XP_022336414.1;Crassostrea gigas， XP_011433150.1;Mizuhopecten yessoensis， OWF54564.1;Penaeus monodon， AGW23550.1;Xenopus laevis， CAA78370.1;Danio rerio， CAA58574.1; Acanthaster planci， XP_022092193.1.圖6 三角帆蚌與其他物種cyclin E氨基酸相似性序列比對(duì)Fig.6 Amino acid sequence similarity alignment of cyclin E among Hyriopsis cumingii and other species

2.4 cyclins基因組織表達(dá)分析

定量分析結(jié)果表明，三角帆蚌cyclins基因mRNA在閉殼肌、斧足、外套膜、心臟、血液、內(nèi)臟團(tuán)、鰓、性腺中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)出不同的組織與性別差異。

cyclinA基因在三角帆蚌雌雄個(gè)體各個(gè)組織中均有表達(dá)，在性腺中表達(dá)量最高，顯著(P<0.05)高于其他組織，在血液、閉殼肌、內(nèi)臟團(tuán)、心臟中表達(dá)量也較高(圖7-A)。在心臟中，雌性cyclinA表達(dá)量顯著高于雄性(P<0.05)；在性腺中，雌性cyclinA表達(dá)量約為雄性的15倍，差異極顯著(P<0.01)；在閉殼肌和血液中，雄性cyclinA表達(dá)量顯著高于雌性(P<0.05)(圖7-B)。

組間無相同字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。Values without the same letters were significantly different (P<0.05);* indicated P<0.05， ** indicated P<0.01. The same as below.圖7 cyclin A基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of cyclin A

cyclinD2基因在三角帆蚌雌雄個(gè)體各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，在鰓中表達(dá)量顯著(P<0.05)高于其他組織，在斧足、外套膜、心臟中表達(dá)量也較高(圖8-A)。在外套膜中，雌性cyclinD2表達(dá)量顯著(P<0.05)高于雄性；在心臟和性腺中，雄性cyclinD2表達(dá)量均顯著(P<0.05)高于雌性，其他組織cyclinD2基因表達(dá)量無性別差異(圖8-B)。

圖8 cyclin D2基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression level ofcyclin D2

cyclinE基因在三角帆蚌雌雄個(gè)體各個(gè)組織中也均有表達(dá)，其中，在性腺中表達(dá)量顯著(P<0.05)高于其他組織，鰓、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌、血液中表達(dá)量也較高(圖9-A)。在斧足、心臟中，雌性cyclinE表達(dá)量顯著(P<0.05)高于雄性；在性腺中，雌性cyclinE表達(dá)量約為雄性的5倍，差異極顯著(P<0.01)。在鰓中，雄性cyclinE表達(dá)量顯著(P<0.05)高于雌性(圖9-B)。

圖9 cyclin E基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression level of cyclin E

3 討論

細(xì)胞周期蛋白最早被發(fā)現(xiàn)于海膽中[20]，隨后在高等生物中鑒定出了多種細(xì)胞周期蛋白，各種周期蛋白通過與CDK結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的分裂[21]。研究表明，細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)失調(diào)與細(xì)胞凋亡、多種癌癥發(fā)生有密切關(guān)系[22]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組文庫，從中篩選出了三角帆蚌cyclinA、cyclinD2、cyclinE基因，并進(jìn)行了生物信息和表達(dá)分析。

通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三角帆蚌cyclin A、cyclin D2均具有周期蛋白標(biāo)志性的周期蛋白框，而cyclin E因序列較短未得到比對(duì)結(jié)果。氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果表明，三角帆蚌cyclin A、cyclin D2、cyclin E與牡蠣、扇貝等雙殼貝類氨基酸相似性較高，這進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組所篩選出的基因?yàn)槿欠黾?xì)胞周期蛋白基因。

細(xì)胞周期的調(diào)控中，cyclin A、cyclin B被認(rèn)為是M期周期蛋白，cyclin E是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換的周期蛋白，cyclin A與cyclin B可以通過不同方式激活MPF，誘導(dǎo)減數(shù)分裂[23]。本實(shí)驗(yàn)中，cyclinA、cyclinE基因在三角帆蚌性腺中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織。Li等[8]在鱟(Tachypleustridentatus)中發(fā)現(xiàn)，cyclinA基因與卵巢發(fā)育密切相關(guān)，隨著卵巢的發(fā)育cyclinA表達(dá)量逐漸增加，卵巢發(fā)育過程中，大量細(xì)胞開始增殖，cyclinA基因的高表達(dá)與生殖細(xì)胞的分裂活動(dòng)有關(guān)。劉佳敏等[18]研究表明，三角帆蚌cyclinB基因與cyclinA具有相似的組織表達(dá)特性，推測(cè)在細(xì)胞周期調(diào)控中，cyclinA、cyclinB可能發(fā)揮相似的功能。此外，Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在性腺組織中雌性擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)cyclinA表達(dá)量顯著高于雄性，本研究結(jié)果與此一致，暗示cyclinA在三角帆蚌卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，作為細(xì)胞分裂旺盛的組織，其與生殖細(xì)胞的分裂活動(dòng)有關(guān)。cyclinE在水生動(dòng)物性腺發(fā)育過程中的作用研究較少。趙超等[24]發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)卵巢中cyclinE也存在高表達(dá)現(xiàn)象，暗示cyclinE基因與cyclinA相似，其表達(dá)可能也與性腺發(fā)育有密切關(guān)系。

cyclinD在G0期細(xì)胞受到有絲分裂原刺激后表達(dá)，是一類調(diào)控G1-S期轉(zhuǎn)變的周期蛋白，可作為一種細(xì)胞增殖潛能的指標(biāo)，用于腫瘤發(fā)生的預(yù)后[25]。cyclinD1為原癌基因，在對(duì)人類多種腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)cyclinD1基因的持續(xù)高表達(dá)[22，26]。本研究選用的三角帆蚌為5月份購置暫養(yǎng)的2齡蚌，此時(shí)為蚌的繁育時(shí)期，其受精卵發(fā)育在鰓套腔中進(jìn)行[27]，且鰓是三角帆蚌重要的呼吸和濾食器官；研究中發(fā)現(xiàn)，三角帆蚌cyclinD2基因在鰓中的表達(dá)量顯著高于其他組織，暗示三角帆蚌鰓組織細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，也可能與鰓細(xì)胞的損傷修復(fù)或處于繁育時(shí)期的生理狀態(tài)有關(guān)。