利用CRISPR_Cas9技術(shù)創(chuàng)建擬南芥Argonaute2基因缺失突變體

李紅英，高延武，于茹恩，王政博，李雪萍，劉龍昌

(河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

RNA沉默(RNA silencing)是真核生物中廣泛存在的一種內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，也是植物中主要的防御體系[1-2]。ARGONAUTEs(AGOs)蛋白是RNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合體(RISC)的核心蛋白[3]，協(xié)同小分子RNA在轉(zhuǎn)錄水平(transcriptional gene silencing，TGS)或者轉(zhuǎn)錄后水平(posttranscriptional gene silencing，PTGS)靶向修飾DNA或者沉默RNA[4-5]，產(chǎn)生特異性基因沉默作用，被稱為RNA沉默效應(yīng)的執(zhí)行者。不同植物AGO數(shù)量差別較大，基于蛋白相似性的進(jìn)化關(guān)系可歸為3個(gè)進(jìn)化分支：AGO1/5/10、AGO2/3/7和AGO4/6/8/9，單子葉植物水稻和玉米的AGO18單獨(dú)歸為一支[6]。其中，AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10已被證明在植物抗病通路中發(fā)揮重要作用[7]，并且AGO成員之間也會(huì)產(chǎn)生相互作用進(jìn)而影響功能[8-9]。

基因編輯是近幾年快速發(fā)展起來(lái)的對(duì)基因組靶序列進(jìn)行精確編輯的一種技術(shù)。該技術(shù)可以對(duì)目的基因進(jìn)行堿基插入、缺失等定點(diǎn)編輯，產(chǎn)生特定基因功能失活突變體，從而為生物體功能基因組學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)遺傳材料。源自細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的CRISPR_Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromicrepeats /CRISPR-associated nuclease，Cas9)是第3代基因組編輯技術(shù)，具有高效、便捷、成本低廉、能夠?qū)崿F(xiàn)全基因組編輯和多靶點(diǎn)編輯等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。該技術(shù)通過(guò)在目標(biāo)物種基因組DNA上選擇需要改造的基因靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)向?qū)NA (single-guide RNA，sgRNA)，然后連入Cas9基因構(gòu)成表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出sgRNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白靶向結(jié)合到基因組DNA目標(biāo)基因靶點(diǎn)，使其產(chǎn)生雙鏈斷裂，然后通過(guò)非同源末端連接或同源重組的修復(fù)方式，引起目的基因突變，從而實(shí)現(xiàn)基因組靶目標(biāo)位點(diǎn)的編輯[12]。

突變體是植物基因功能研究的重要材料，要精確解析每個(gè)基因的功能與基因間的相互作用，必須分析單個(gè)基因和多個(gè)基因的突變表型，以及它們的時(shí)空表達(dá)剖面[13]。模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)有10個(gè)AGO蛋白成員[14]，借助豐富的擬南芥T-DNA插入和點(diǎn)突變等多種強(qiáng)突變體和弱突變體，AGO1(At1g48410)成為研究最為透徹的AGO蛋白[15]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)AGO2(At1g31280)在植物抵御病毒入侵中相比其他AGO蛋白可能具有更多樣化的抗病毒能力[8]，但具體機(jī)制還不清晰。atago2-1突變體還表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌性病害的不耐受[16]，深入研究揭示AGO2可通過(guò)調(diào)控精胺酸甲基化調(diào)節(jié)細(xì)菌免疫[17]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，AtAGO2可結(jié)合MUG13.4蛋白參與調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)[18]，表明AGO2的多樣性角色。相比AGO1，擬南芥AGO2突變體類型和數(shù)量均較少。已報(bào)道的擬南芥AGO2研究多采用歐洲擬南芥突變體中心提供的T-DNA插入突變體，突變類型比較單一，并且外源T-DNA插入突變體隨著繁殖代數(shù)的增加容易產(chǎn)生外源T-DNA基因沉默。因此，本研究擬利用最新基因編輯技術(shù)，構(gòu)建AGO2基因CRISPR_Cas9敲除載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得可穩(wěn)定遺傳的AGO2基因苷酸缺失/插入類型突變體，為后續(xù)AGO2抗病和發(fā)育調(diào)控功能研究提供不同突變類型的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(A.thaliana)：哥倫比亞生態(tài)型種子(Columbia，Col-0)，由河南科技大學(xué)園林實(shí)驗(yàn)中心保存。pYLCRISPR/Cas9-DH植物表達(dá)載體系統(tǒng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授饋贈(zèng)。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101感受態(tài)細(xì)胞和大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

PCR擴(kuò)增酶PrimeSTAR、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物片段純化試劑盒等購(gòu)自Takara公司。限制性內(nèi)切酶BsaⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。pTOPO-Blunt Simple克隆載體購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基各成分、MS粉、抗生素等生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1AGO2基因編輯靶點(diǎn)選擇與gRNA引物設(shè)計(jì)

基于擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR10，http://www.arabidopsis.org)，利用在線工具CRISPR-GE[19](http://skl.scau.edu.cn/)查找擬南芥AGO2(AT1G31280)包含Cas9識(shí)別位點(diǎn)PAM序列的片段，以PAM序列之前20 nt的序列作為編輯靶位點(diǎn)序列，根據(jù)靶點(diǎn)位置、GC含量和網(wǎng)站預(yù)測(cè)的脫靶率確定靶點(diǎn)。為了降低脫靶率，進(jìn)一步選擇候選靶序列所在位置上下游各50 bp，利用NCBI網(wǎng)站Blast工具進(jìn)行同源性搜索比對(duì)。之后使用CRISPR-GE子工具“primerDesign”進(jìn)行靶點(diǎn)接頭引物設(shè)計(jì)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，純化方式為iPAGE，序列如表1所示。

將每個(gè)靶點(diǎn)的接頭引物用TE溶解成100 μmol·L-1母液，各取1 μL正反向靶點(diǎn)引物加入到98 μL TE混合稀釋為1 μmol·L-1。在PCR儀中90 ℃ 反應(yīng)2 min拿出，室溫自然冷卻完成退火，得到靶位點(diǎn)雙鏈結(jié)構(gòu)靶片段，末端磷酸化處理后以備下步中間載體構(gòu)建使用。

1.3.2 AGO2靶點(diǎn)片段擴(kuò)增、sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建與擴(kuò)增

本套CRISPR_Cas9載體系統(tǒng)包含了雙元的植物表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9-DH和針對(duì)T1到T3的3個(gè)sgRNA表達(dá)盒中間載體，前者以CaMV35S啟動(dòng)子表達(dá)Cas9，后者分別以AtU3b、AtU3d和AtU6-1 3個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)。首先利用同時(shí)酶切和連接方法，在3個(gè)PCR反應(yīng)體系中分別加入BsaⅠ內(nèi)切酶約5 U、T4 DNA連接酶約30 U、sgRNA表達(dá)盒中間載體20 ng，以及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的正反向接頭引物各0.05 μmol·L-1，混勻后離心，置于PCR儀中；37 ℃ 5 min，20 ℃ 5 min，5個(gè)循環(huán)；將3個(gè)靶點(diǎn)分別連入AtU3b、AtU3d和AtU6-1 3個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒中。然后利用克隆框接頭引物U-F/靶點(diǎn)接頭反向引物配對(duì)，靶點(diǎn)接頭正向引物/克隆框接頭引物gRNA-R配對(duì)，以上一步獲得的表達(dá)盒為模板，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后每個(gè)靶點(diǎn)分別取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合作為模板，再利用3對(duì)位置特異引物Uctcg-B1′/gRctga-B2、Uctga-B2′/gRaaga-B3、Uaaga-B3′/gRcggt-BL，分別擴(kuò)增出含3個(gè)靶點(diǎn)片段的gRNA表達(dá)盒。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度后備用。

1.3.3 雙元表達(dá)載體構(gòu)建

利用Golden Gate cloning方法[20]，采取邊酶切邊連接策略，在15 μL反應(yīng)體系中加入上一步獲得的PCR純化產(chǎn)物50 ng，pYLCRISPR_Cas9-DH載體100 ng，以及10 UBsaⅠ內(nèi)切酶和30 U T4DNA連接酶，進(jìn)行Cas9載體和多個(gè)gRNA表達(dá)盒片段的連接組裝。反應(yīng)條件為37 ℃ 2 min，10 ℃ 3 min，20 ℃ 5 min，15個(gè)循環(huán)；37 ℃保持2 min。取部分連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在含50 μg·mL-1卡那霉素LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，然后挑取單菌落送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將連接成功的克隆提取質(zhì)粒保存。

1.3.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，涂平板后置于28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素和17 μg·mL-1利福平)振蕩培養(yǎng)，利用花序浸染法[21]轉(zhuǎn)化擬南芥植株，培養(yǎng)至種子成熟后收種。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因植株篩選與鑒定

將收獲的種子自然干燥，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒后均勻播撒在含25 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基平板上，置于4 ℃放置72 h，然后于光照培養(yǎng)條件下篩選，15 d后根據(jù)幼苗根生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)抗性苗數(shù)量，并移栽至育苗土中繼續(xù)培養(yǎng)。待苗長(zhǎng)至6片真葉后，取部分葉片采用CTAB法提取基因組DNA，同時(shí)提取野生型葉片作為陰性對(duì)照。利用潮霉素基因片段引物Hyg-F/R(表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)。

表1 引物序列

1.3.6 轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)編輯情況檢測(cè)

以10株長(zhǎng)勢(shì)良好的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，根據(jù)靶點(diǎn)所在片段設(shè)計(jì)上下游引物C9AtAGO2-seq-F和C9AtAGO2-seq-R(序列如表1所示)，PCR擴(kuò)增AGO2基因包含靶位點(diǎn)的目標(biāo)DNA片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化后涂平板，每個(gè)平板挑10個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMan對(duì)所有測(cè)序獲得的序列和擬南芥參考基因組AGO2基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA靶點(diǎn)序列選擇與sgRNA引物設(shè)計(jì)

從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥AGO2(AT1G31280)基因組DNA序列和CDS序列，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，擬南芥AGO2共有5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(圖1)。擬南芥AGO家族中共有10個(gè)成員，為了避免脫靶敲除該家族其他成員，對(duì)其蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)分析(結(jié)果未顯示)，選擇該基因5′端保守性較差的外顯子序列為目標(biāo)進(jìn)行靶點(diǎn)設(shè)計(jì)。參照CRISPR-GE在線工具使用說(shuō)明，將AGO2基因DNA序列上游約1 000 bp長(zhǎng)度輸入targetDesign子工具，并調(diào)整相關(guān)參數(shù)，選擇PAM類型為NGG，靶點(diǎn)長(zhǎng)度設(shè)為20 bp，對(duì)給出的潛在靶點(diǎn)列表進(jìn)一步按照“脫靶可能性”進(jìn)行排序，且GC含量大于50%，最終選定3個(gè)序列為靶點(diǎn)序列，分別為T1：5′-ATGGAGAGAGGTGGTTATCG-3′；T2：5′-TCCGTCCACCAGCACCACCG-3′；T3：5′-GCCACAACTCCGCCTCTATC-3′。3個(gè)靶點(diǎn)分別位于AGO2基因起始密碼子ATG后第一和第二個(gè)外顯子上(圖1)，跨度約850 bp。

圖1 AtAGO2基因結(jié)構(gòu)與敲除靶點(diǎn)位置信息Fig.1 Structure of AtAGO2 and location of target sites

2.2 sgRNA克隆框連接與擴(kuò)增

將每對(duì)靶點(diǎn)引物分別進(jìn)行變性退火后形成的引物二聚體，通過(guò)酶切連接方法依次插入擬南芥來(lái)源的3個(gè)small nuclear RNA啟動(dòng)子AtU3b、AtU3d和AtU6-1后，再利用2輪巢式PCR擴(kuò)增得到特異性目標(biāo)產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)顯示，目的條帶符合預(yù)期，其中AtU3b-gRNA、AtU3d-gRNA、AtU6-1-gRNA電泳條帶大小分別約為284 bp、507 bp和487 bp。

2.3 植物雙元表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9-DH-AtAGO2的構(gòu)建

通過(guò)BsaⅠ切除pYLCRISPR/Cas9-DH載體(潮霉素抗性)上的ccdB片段，同時(shí)在酶切體系中加入T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，將上一步獲得的3個(gè)靶點(diǎn)表達(dá)盒擴(kuò)增產(chǎn)物連入線性化的pYLCRISPR/Cas9-DH載體，構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌后經(jīng)菌落PCR鑒定，初步確定目標(biāo)片段連入表達(dá)載體；挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，分別與3個(gè)靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)，確定CRISPR敲除載體構(gòu)建成功(圖3-a)。將其命名為pCC9AtAGO2，載體結(jié)構(gòu)如圖3-b所示。

M，DL 2000 marker；T1，靶點(diǎn)1；T2，靶點(diǎn)2；T3，靶點(diǎn)3。M， DL 2000 marker; T1， Target site 1; T2， Target site 2; T3， Target site 3.圖2 AtAGO2 3個(gè)靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 Gel electrophoresis detection of PCR amplification products of three target sgRNA expression cassettes

a，pCC9AtAGO2質(zhì)粒靶位點(diǎn)測(cè)序；b，pCC9AtAGO2載體結(jié)構(gòu)示意圖。a， Sequencing of target sites of pCC9AtAGO2; b， Structure of pCC9AtAGO2.圖3 pCC9AtAGO2質(zhì)粒靶位點(diǎn)序列與載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Sequence of target sites and structure of pCC9AtAGO2 vector

2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化與抗性苗篩選結(jié)果

將重組表達(dá)質(zhì)粒pCC9AtAGO2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101后，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，并通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)入擬南芥，對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行潮霉素抗性篩選，共獲得62棵T1代抗性苗。使用潮霉素基因特異片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果(圖4)顯示，除少量抗性苗未擴(kuò)增出條帶外，共計(jì)有53株成功擴(kuò)增出約700 bp目的條帶，表明成功轉(zhuǎn)化53棵轉(zhuǎn)基因植株。

M，DL 2000 DNA marker；1～19，轉(zhuǎn)基因擬南芥潮霉素抗性陽(yáng)性苗；wt，野生型。M， DL 2000 DNA marker; 1-19， Positive seedlings of transgenic lines with hygromycin B tolerance; wt， Wild type.圖4 部分抗性苗潮霉素基因特異片段PCR擴(kuò)增檢測(cè)Fig.4 PCR amplification detection of hygromycin B gene in T0 transgenic plants with hygromycin B tolerance

2.5 AtAGO2突變體檢測(cè)

為了驗(yàn)證構(gòu)建的pCC9AtAGO2基因編輯載體是否具有打靶效應(yīng)，能否在預(yù)期設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)處產(chǎn)生基因組DNA序列的編輯，對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代植株AGO2基因靶序列進(jìn)行測(cè)序分析。包含3個(gè)靶點(diǎn)的引物C9AtAGO2-seq-F和C9AtAGO2-seq-R PCR擴(kuò)增片段預(yù)期大小868 bp(圖5)，PCR產(chǎn)物連入克隆載體。單克隆測(cè)序結(jié)果表明，隨機(jī)選擇的10株轉(zhuǎn)基因材料中，第1個(gè)靶點(diǎn)附近6株產(chǎn)生了編輯，第2個(gè)靶點(diǎn)附近10株全部成功編輯，第3個(gè)靶點(diǎn)所測(cè)材料均未發(fā)生編輯。其中，4株材料的第2個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的克隆測(cè)序檢測(cè)到野生型帶型(#2、#41、#49和#54)，說(shuō)明可能為雜合型。進(jìn)一步對(duì)全部發(fā)生編輯的前2個(gè)靶點(diǎn)的所有克隆進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，第1靶點(diǎn)和第2靶點(diǎn)均產(chǎn)生了多種編輯形式的多態(tài)，其中以PAM前刪除或者增加1個(gè)堿基的形式出現(xiàn)頻率較高，同時(shí)也檢測(cè)到刪除10～40個(gè)堿基的編輯形式，最長(zhǎng)可刪除106個(gè)堿基(圖6)。突變類型以缺失突變方式較多，缺失數(shù)目較為隨機(jī)，也有出現(xiàn)個(gè)別位點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換或者顛換的情況。

M，DL 2000 DNA marker；#2～#54，轉(zhuǎn)基因T1代植株。M，DL 2000 DNA marker; #2-#54， T1 transgenic plants.圖5 部分轉(zhuǎn)基因T1代植株AGO2基因編輯靶點(diǎn)所在DNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of AGO2 gene fragments containing editing target sites of selected transgenic lines

a，靶點(diǎn)1編輯形式；b，靶點(diǎn)2編輯形式。a， Editing forms of target T1; b， Editing forms of target T2.圖6 部分轉(zhuǎn)基因T1代植株AGO2靶點(diǎn)編輯形式Fig.6 Editing forms of AGO2 target site of selected T1 transgenic progenies

3 結(jié)論與討論

本研究采用CRISPR_Cas9基因沉默技術(shù)創(chuàng)制擬南芥突變體，利用3個(gè)位點(diǎn)特異的sgRNA對(duì)AGO2基因進(jìn)行靶向編輯。基于劉耀光課題組開(kāi)發(fā)的CRISPR_Cas9系統(tǒng)[22]，成功構(gòu)建了AGO2基因編輯載體，并轉(zhuǎn)入擬南芥中，載體抗性特異引物檢測(cè)表明，篩選得到T1代陽(yáng)性苗53株。隨機(jī)挑選10個(gè)轉(zhuǎn)基因單株，利用特異引物將包含靶點(diǎn)序列的DNA片段擴(kuò)增后構(gòu)建克隆，并挑取多個(gè)克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果表明，成功獲得了有效的AGO2基因核苷酸缺失/插入突變體，且有多種形式的突變。

AGO蛋白是RNA沉默通路中的重要蛋白，多個(gè)成員已被證明參與到植物小RNA介導(dǎo)的抗病調(diào)控途徑[7]，其中，AGO1和AGO2是最重要的2個(gè)成員。擬南芥AGO1是最早被發(fā)現(xiàn)的植物AGO蛋白，也是目前研究最為透徹的AGO蛋白；AGO2的功能近年來(lái)也逐漸受到重視。擬南芥T-DNA插入突變體ago2(SALK_003380)表現(xiàn)出對(duì)多種病毒和細(xì)菌的敏感性，表明AGO2在植物抗病過(guò)程中具有不可或缺的作用[7，16]，它協(xié)同AGO1作為植物抗病的第二道防線，參與次級(jí)抗病毒過(guò)程[23]。利用一種新型病毒誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)(VIGS)對(duì)擬南芥AGO2進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)AGO2參與DCL4介導(dǎo)的抗病反應(yīng)[24]。最近有研究利用RNAi技術(shù)特異性降低煙草(Nicotianabenthamiana)AGO2表達(dá)[25]，證實(shí)NbAGO2在病毒侵入不同階段扮演“減速機(jī)”的角色。

利用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對(duì)二倍體植物基因編輯后，植株多產(chǎn)生簡(jiǎn)單突變，如純合突變、雙等位突變和雜合突變[22]。本研究靶點(diǎn)1獲得的測(cè)序克隆結(jié)果中，僅有4株明確發(fā)生了編輯，在PAM上游位置插入或者刪除1個(gè)堿基A的編輯形式出現(xiàn)頻率較高，也有在PAM上游刪除2個(gè)或者多個(gè)堿基的編輯形式出現(xiàn)，也有發(fā)現(xiàn)有對(duì)PAM本身與下游附近區(qū)域進(jìn)行編輯的形式。在10株測(cè)序株系中，靶點(diǎn)2的克隆測(cè)序結(jié)果也顯示，在PAM上游4個(gè)堿基處插入或刪除1個(gè)堿基的編輯形式以高頻率出現(xiàn)，占該位點(diǎn)獲得克隆總數(shù)的近一半(47%)，這是CRISPR_Cas9介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂再修復(fù)過(guò)程中的常見(jiàn)類型[22]。部分克隆中發(fā)生了PAM位點(diǎn)附近區(qū)域刪除10～40個(gè)堿基的短片段編輯，最長(zhǎng)有刪除106個(gè)堿基片段的編輯形式，可導(dǎo)致AtAGO2蛋白保守結(jié)構(gòu)域的缺失，從而導(dǎo)致基因功能喪失。說(shuō)明不同位點(diǎn)的編輯效果不同，同一位點(diǎn)的編輯類型也有較大差異。第3個(gè)靶點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生編輯，除了靶點(diǎn)的原因之外，可能跟本研究所用表達(dá)載體的編輯效率也有較大關(guān)系。有研究以現(xiàn)有CRISPR_Cas9載體系統(tǒng)為起點(diǎn)優(yōu)化改造了相應(yīng)的載體及其構(gòu)建方法，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，在單子葉植物水稻中獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率[26]。

擬南芥中有10個(gè)AGO蛋白，每個(gè)AGO的單突變體都不會(huì)導(dǎo)致植株死亡，只有ago1功能缺失突變體表現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育缺陷[14]。本研究測(cè)序驗(yàn)證10株AGO2轉(zhuǎn)基因植株，在第1靶點(diǎn)1或第2靶點(diǎn)發(fā)生編輯的植株共有6株為純合體，從形態(tài)發(fā)育上看，在正常培養(yǎng)條件下沒(méi)有表現(xiàn)出和野生型明顯的差別(數(shù)據(jù)未顯示)；之前使用T-DNA插入產(chǎn)生的功能缺失突變體ago2-1為材料的研究多集中于抗病相關(guān)方面，也未見(jiàn)有此方面的報(bào)道，擬南芥AGO2是否影響植株形態(tài)發(fā)育需要進(jìn)一步確認(rèn)。近期有研究在水稻(OryzasativaL.)中發(fā)現(xiàn)，敲除OsAGO2可導(dǎo)致水稻花藥發(fā)育缺陷[27]，表明AGO2在植物雄株生殖發(fā)育中扮演重要角色。本研究出于試驗(yàn)?zāi)康目紤]未對(duì)獲得的基因編輯材料進(jìn)行深入的表型分析和病原菌脅迫鑒定，尚未確定不同編輯形式的AGO2是否在功能上有差異。有研究報(bào)道表明，CRISPR_Cas9基因編輯載體靶向基因序列位置的不同，導(dǎo)致純合突變體植株呈現(xiàn)出的表型也有差異[26]。與基于RNAi技術(shù)產(chǎn)生的突變體相比，利用基因編輯方法創(chuàng)制的煙草功能缺失突變體ago2表現(xiàn)出對(duì)多種入侵病毒比較敏感[28]，說(shuō)明基于CRISPR_Cas9技術(shù)創(chuàng)制的遺傳材料攜帶的基因突變形式更為多樣，可為深入研究目標(biāo)基因的功能機(jī)制提供豐富的遺傳材料。