兔流行性腹脹病病原分離鑒定與防治

季權(quán)安，劉 燕，肖琛聞，黃葉娥，李 科，韋 強，鮑國連

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

兔流行性腹脹病是由特定病原引起的以腹脹為典型臨床特征的家兔傳染病[1]，自2004年春開始在我國各地流行，具有高發(fā)病率和高死亡率[2]。關(guān)于兔流行性腹脹病的病因，目前尚無定論，生產(chǎn)上也還沒有較為有效的治療措施[3]。為了早日探明病因，作者團隊先后在浙江省臺州臨海(LH)、嘉興嘉善(JS)、杭州富陽(FY)等地的30多家規(guī)模兔場開展流行病學調(diào)查，從上百例被檢病死兔病樣中分離病原菌，其中，居首位的是大腸埃希菌(Escherichiacoli)，排其次的是魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)。另外，團隊人員還從病死兔的糞便和腸黏膜樣品中鏡檢到少量球蟲卵囊。據(jù)此，我們認為該病可能是一種以魏氏梭菌為主，單一或混合大腸埃希菌、沙門氏菌感染所致的傳染病[4]。大腸埃希菌和魏氏梭菌容易產(chǎn)生耐藥性，用化學藥物進行控制，不但成本高、效果差異大，還易造成藥物殘留。當前，我國正在實行飼料端全面禁抗(生素)、養(yǎng)殖端減抗限抗，因此對新型、綠色抗生素替代品的探尋已迫在眉睫。溶菌酶(LZ)具有殺菌免疫功能[5]，于1921年由蘇格蘭生物學家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)[6]，是動物上重要的非特異性免疫因子。革蘭氏陽性菌(G+)的細胞壁和革蘭氏陰性菌(G-)的內(nèi)壁層幾乎全部由肽聚糖組成，LZ能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，使細胞溶解死亡[7]，從而達到抗菌消炎的目的。LZ與抗生素的殺菌機制不同，不易產(chǎn)生耐藥性，具有安全、無殘留、活性穩(wěn)定等優(yōu)良特性[8]。為了有效防治兔流行性腹脹病，根據(jù)流行病學調(diào)查與病原分離鑒定結(jié)果，本研究選取LH、JS、FY的3家兔流行性腹脹病常發(fā)場，開展LZ臨床防治試驗研究。現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

供試小白鼠40只，體重在30～50 g，購自浙江省中醫(yī)藥大學。供試幼兔56只，2月齡左右，體重在1.0～1.5 kg，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所試驗兔場提供。

另選取LH、JS、FY的3個常發(fā)病兔場的60日齡無癥狀兔，及經(jīng)實驗室確診、癥狀輕重不一的流行性腹脹病患兔用于預防和治療試驗。

1.1.2 藥品和主要試劑

LZ(酶活力≥500 U·mg-1，批號為200423)，由浙江艾杰斯生物科技有限公司提供；普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、姬姆薩氏染色液由本實驗室配制；血瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，及生化試驗用各種糖發(fā)酵管、甘露醇、甲基紅(MR)試劑、VP試劑、尿素酶試劑、H2S，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。其他相關(guān)化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調(diào)查

深入主要養(yǎng)殖地區(qū)實地走訪，組織浙江省臺州、嘉興、寧波、紹興、杭州等地的養(yǎng)殖戶主、飼養(yǎng)人員、診治獸醫(yī)開展座談，詢問養(yǎng)殖場發(fā)病現(xiàn)狀、臨床癥狀、防治措施與效果，以及同群和鄰群、本場和當?shù)赝脠鲇袩o類似病例。入場抽查，現(xiàn)場觀察位于LH、JS、FY的3個常發(fā)病兔場的病情，詳細了解飼養(yǎng)、管理、環(huán)境衛(wèi)生、飼料質(zhì)量、水源安全等情況。借助統(tǒng)計學方法，對流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)進行比較分析。

1.2.2 臨床剖檢與病理變化觀察

將病死兔頭朝左，右側(cè)臥于解剖臺上，用帶鉤鑷子配合剪刀解開體表，露出左側(cè)胸腹部，然后從腹部朝兔頭方向剪去整個腹部肌肉，用大剪去掉前胸廓，露出整個胸腹腔，逐一查視心、肝、脾、肺、腎、氣管、腸系膜淋巴結(jié)等器官、組織是否充血、出血、腫脹，有無變性、壞死灶、灰白色結(jié)節(jié)等病變，觀察胃、十二指腸、空腸、結(jié)腸、盲腸內(nèi)容物狀況，及胃、腸黏膜有無脫落，胃是否膨大、充滿氣體和液體。

1.2.3 病原分離鑒定

無菌采集心、心包液、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)、胃內(nèi)容物、小腸內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物。將上述內(nèi)臟病料接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)特征均一的菌落傳代純化，將純化的培養(yǎng)物再次劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色鏡檢。將純化后的病原菌按照常規(guī)方法進行生化試驗，并將純化后的病原菌接種到幼兔體內(nèi)進行復壯培養(yǎng)，提取后供致病力試驗用。

用上述肉湯培養(yǎng)物(即將無菌采集到的病料接種于肉湯培養(yǎng)基后經(jīng)純化復壯培養(yǎng)的菌毒，亦稱復壯毒)注射小鼠(經(jīng)預試驗確定每只注射0.02 mL)和2月齡左右的供試兔(經(jīng)預試驗確定每只注射0.5 mL)，24 h后觀察死亡和病變情況。

人工發(fā)病試驗：取上述腸內(nèi)容物(含小腸內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物)用超純水3倍稀釋，無菌紗布過濾，1 000×g離心15 min，灌喂健康幼兔4只，每只1 mL，另設(shè)對照組4只。

取病死兔病變部結(jié)節(jié)或刮屑物進行壓片或涂片，用姬姆薩氏液染色，鏡檢各型蟲體。應用飽和鹽水漂浮法鏡檢球蟲卵囊：取新鮮兔糞5～10 g放入量杯中，先加少量飽和鹽水將兔糞搗爛混勻，再加飽和鹽水到50 mL，將糞液用雙層紗布過濾，濾液靜置15～30 min，取浮液鏡檢球蟲卵囊數(shù)量。

1.2.4 預防與治療試驗

分別在LH、JS、FY常發(fā)病兔場采用LZ進行臨床防治試驗。選取60日齡無癥狀兔開展預防試驗，選取經(jīng)實驗室確診、癥狀輕重不一的流行性腹脹病患兔進行治療試驗。每個兔場設(shè)4組，即將預防試驗和治療試驗均隨機分為處理組和對照組，每組45只。預防試驗中，處理組每100 kg全價飼料添加10 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～50 g的量(即按照兔體重7%的比例，下同)飼喂，連用5 d；治療試驗中，處理組每100 kg飼料添加20 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～100 g的量飼喂，連用5 d。預防試驗和對照試驗中，對照組飼料中均不添加任何藥物。觀察、統(tǒng)計各組的發(fā)病、死亡和治愈只數(shù)。

防治效果的判定標準如下：腹脹消失，精神、食欲正常的判為治愈；預防過程中出現(xiàn)精神不振、食欲減退、腹部膨脹等現(xiàn)象，觸摸腹部有明顯的硬物感，伴有不同程度的腹瀉或便秘的判為發(fā)??；防治過程中發(fā)生死亡的判為病死。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果

流行病學調(diào)查結(jié)果與業(yè)內(nèi)學者觀點基本相符：該病不分品種、不分季節(jié)均可發(fā)病，但以春、秋季高發(fā)，發(fā)病率普遍在30%～60%，病死率達90%以上，病情嚴重兔場病死率高達100%。發(fā)病兔以斷奶至3月齡為主，尤以40～70日齡發(fā)病率最高，成年兔少發(fā)，未見哺乳期發(fā)病。發(fā)病期普遍持續(xù)1～3周，最長可達1個月以上，部分兔場間隔一段時間會復發(fā)。該病呈地方流行性，不同地區(qū)間有較大差異。

調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，LH、JS的飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生相較于FY差，發(fā)病情況相對更嚴重。添加抗球蟲藥物、抗菌藥物進行防治的養(yǎng)殖場大多反映效果不佳或不明顯。

2.2 臨床癥狀和病理變化

觀察臨床病癥發(fā)現(xiàn)，多數(shù)病死兔腹部膨脹如鼓(圖1)，觸摸腹部有明顯硬物感，肛周圍被毛潮濕并伴有糞便污染。剖檢病死兔可見：心、肺、胸腺等臟器有不同程度出血，但肝、脾、腎未見明顯的出血點、壞死灶和灰白色結(jié)節(jié)等病變；胃腸臌氣，積液，部分家兔胃黏膜脫落，潰瘍；腸壁有出血點；盲腸內(nèi)充滿氣體，伴有較硬的塊狀物；有的結(jié)腸、直腸有膠凍樣物。

A，腹部膨脹如鼓，觸摸有硬物感；B，胃黏膜脫落，潰瘍；C，盲腸充滿氣體，內(nèi)容物硬結(jié)。A， Abdominal expansion as drum; B， Gastric mucosa exfoliation and ulcer; C， Caecum filled with gas and content binding.圖1 病死兔的臨床病癥照片F(xiàn)ig.1 Photos of died rabbits

2.3 細菌分離鑒定

針對LH、JS、FY送檢的112例40～90日齡疑似流行性腹脹病患兔進行剖檢。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，部分純化培養(yǎng)菌系兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌。該菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成圓形、表面光滑、濕潤、灰白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上呈紅色菌落(圖2)，在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上呈黑色帶金光菌落。經(jīng)生化試驗鑒定，該菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、鼠李糖，均不產(chǎn)生H2S，尿素酶陰性。將肉湯培養(yǎng)物經(jīng)腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h內(nèi)死亡，且供試小白鼠全部死亡，20只供試兔中死亡19只，致死率達95.0%，病變與自然發(fā)病相同。人工發(fā)病試驗結(jié)果顯示：死亡2只，且從死亡家兔中分離到同種菌，另2只食欲明顯下降；而對照組4只健活。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，分離菌符合大腸埃希菌生化特征。經(jīng)統(tǒng)計，在全部112只送檢患兔中，分離到大腸埃希菌的合計有78只，占比69.6%(表1)，可見，大腸埃希菌是兔流行性腹脹病的主要病原之一。

圖2 大腸埃希菌革蘭氏染色、分離培養(yǎng)(麥康凱培養(yǎng)基)圖Fig.2 Gram staining， isolation and culture (on MacConkey agar) of Escherichia coli

在分離菌中，革蘭氏染色鏡檢還發(fā)現(xiàn)部分菌端鈍圓、有明顯莢膜的革蘭氏陽性粗大桿菌，但未見芽胞。這些分離菌在肉湯培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)基變混濁，并產(chǎn)生大量氣體。將其接種于血瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，形成雙溶血環(huán)的圓形、表面光滑、邊緣整齊的灰白色菌落(圖3)。生化反應顯示，其能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和果糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇。將肉湯培養(yǎng)物經(jīng)腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h死亡，且供試小白鼠全部死亡，20只供試兔中死亡19只，致死率達95.0%，病變與自然發(fā)病相同。人工發(fā)病試驗結(jié)果顯示：死亡2只，且從死亡家兔中均分離到同種菌，另外2只食欲不振；而對照組4只健活。該分離菌的細菌形態(tài)、培養(yǎng)生長特性和生化特性與魏氏梭菌一致。經(jīng)統(tǒng)計，在全部112只送檢患兔中，分離到魏氏梭菌的合計有69只，占比61.6%，與大腸埃希菌的混合感染率為55.4%，可見，混合感染魏氏梭菌是激發(fā)兔流行性腹脹病的主要病原之一。

取病死兔病變部結(jié)節(jié)與刮屑物進行壓片或涂片，經(jīng)姬姆薩氏液染色，鏡檢到少量球蟲體。應用飽和鹽水漂浮法，從糞便濾浮液鏡檢到少量球蟲卵囊，屬于輕微感染。此外，還有少量疑似沙門氏桿菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等未定型雜菌。這些蟲菌數(shù)量極少，并無致病力，亦未能復制到相同病例。

2.4 臨床防治試驗

2.4.1 預防試驗

預防試驗結(jié)果顯示，LZ對兔流行性腹脹病具有明顯的預防效果，3個兔場預防組的發(fā)病率均較對照組降低50個百分點以上(表2)，差異極顯著(P<0.01)，說明LZ可作為養(yǎng)兔場日常預防添加使用。

表2 溶菌酶對兔流行性腹脹病的預防效果

2.4.2 治療試驗

LH、JS、FY三地兔場各取45只患兔，經(jīng)過治療，分別治愈38、40、42只，未得到有效治療而病死的數(shù)量分別為7、5、3只(表3)。結(jié)果顯示，LZ對兔流行性腹脹病具有明顯療效，是治療兔流行性腹脹病發(fā)病的有效藥物，3個兔場治療組的病死率比對照組低70多個百分點(表3)，差異極顯著(P<0.01)。

表3 溶菌酶對兔流行性腹脹病的治療效果

3 結(jié)論與討論

本研究對兔流行性腹脹病進行流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，LH、JS兩地兔場多為經(jīng)驗不足的新建兔場，兔舍衛(wèi)生條件較差，濕度較高，飼養(yǎng)管理不善，飼料質(zhì)量也存在一些問題，從其送檢病例中分離到的魏氏梭菌和大腸埃希菌相對FY的兔場要多，發(fā)病率和病死率也相對更高。王曉梅[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)管理較好的兔場很少發(fā)生兔流行性腹脹病，而衛(wèi)生和管理不善的兔場，如兔舍寒冷、陰暗潮濕、陽光不足、通風不良和環(huán)境衛(wèi)生差的兔場，發(fā)病較為嚴重。本研究經(jīng)實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)管理不善和不利的環(huán)境因素會明顯增加兔流行性腹脹病的發(fā)病率。

大腸埃希菌、魏氏梭菌廣泛存在于各地養(yǎng)兔場。林毅等[4]報道，兔流行性腹脹病的病原菌可能包括魏氏梭菌、巴氏桿菌、大腸埃希菌，系單一或混合感染所致。劉照波等[9]報道了在山東某兔場分離鑒定出魏氏梭菌與大腸埃希菌混合感染的兔流行性腹脹病病例；白國勇等[10]從兔流行性腹脹病病例中分離到以魏氏梭菌和大腸埃希菌為主的多株細菌，且分離菌有一定的致病力。Licois等[11]認為，該病是一種腸道細菌性傳染病。Huybens 等[12]初步證明，兔流行性腹脹病由細菌感染引起，而非病毒或寄生蟲感染引起。Djukovic等[13]發(fā)現(xiàn)，一種新型梭狀芽孢桿菌的腸道定殖與小腸流行性結(jié)腸炎(ERE)的發(fā)生有關(guān)[14]。當發(fā)生ERE時，病兔消化道3個部位的厚壁菌數(shù)量減少，而胃和盲腸內(nèi)魏氏梭菌數(shù)量增加[15]，且在ERE病兔腸道中分離到梭狀芽胞桿菌[16]。目前，雖然尚無研究證明兔流行性腹脹病與較早發(fā)生在法國的ERE屬同一種疾病，但從本研究結(jié)果看，兔流行性腹脹病同樣與魏氏梭菌相關(guān)。作者團隊從LH、JS、FY的上百例病死兔病料中分離到以大腸埃希菌、魏氏梭菌為主的病原菌，認為兔流行性腹脹病是以魏氏梭菌和大腸埃希菌單一或混合感染所致的一種細菌性傳染病，這與學者們認為該病以細菌為主要病原的觀點相吻合，但與Szalo等[15]認為其病原為不可培養(yǎng)的細菌的觀點不盡相同。本研究中，分離到的細菌培養(yǎng)物和復壯毒對供試兔均具有高致死率，且從發(fā)病的供試兔上能分離到同種致病菌，病變與自然發(fā)病相同，與楊加瓊[16]在小白鼠和試驗兔上均能復制相同病例的結(jié)果相符。

隨著行業(yè)監(jiān)管力度加大，飼料已進入全程無抗化的新階段，但這也加大了畜禽消化道細菌性疾病的防控難度。篩選、研發(fā)抗生素替代物勢在必行。以往，大腸埃希菌、魏氏梭菌類細菌性疾病主要依賴抗生素防治，養(yǎng)殖場(戶)為了防控疾病，濫用抗生素和化學藥品，造成耐藥菌株增多、藥物殘留嚴重等不良影響。LZ是機體非特異性免疫因子之一，既能抗菌，又能增強動物機體免疫力[17-18]，能有效降低發(fā)病率和病死率，且無毒無害，近年來受到越來越多人的關(guān)注[19]。Epaud等[5]發(fā)現(xiàn)，供給外源性LZ會增強動物機體對細菌的殺滅能力；Oliver等[20]研究表明，LZ與抗生素的使用效果相當；May等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LZ在無抗生素的畜禽飼糧中使用，能夠達到與抗生素飼糧同樣的促生長效果。本研究表明，LZ用于兔流行性腹脹病治療時具有治愈率高、恢復快的特點，無毒副作用，經(jīng)口服給藥不會產(chǎn)生應激反應。更為重要的是，LZ無殘留，不會對下游的食物鏈產(chǎn)生負面影響，是一種具有完全替代抗生素潛能的綠色飼料添加劑。由于LZ具有快速高效的優(yōu)點，在各地普及應用后，可最大限度地減少養(yǎng)殖場(戶)的防控成本，使其免遭或挽回部分經(jīng)濟損失。在疫苗等更為先進的防治措施落地前，LZ可作為當前防治兔流行性腹脹病的首選藥。