維生素A對大豆7S球蛋白致仔豬腸上皮細胞屏障功能損傷的影響

楊 菊， 鄧俊良， 夏江英， 宋天浩， 龐蓮鳳， 任志華

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室/環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川 成都 611130)

仔豬早期斷奶是提高母豬繁殖效益的重要技術手段，但斷奶后腹瀉導致的仔豬體重流失、生長性能降低給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。有研究指出，大豆抗原蛋白導致的斷奶仔豬腸道損傷是仔豬斷奶后腹瀉的根本原因[1-2]，大豆抗原蛋白的熱穩(wěn)定性較強且具有一定的抗消化性[3]，難以通過膨化、酶解等方式被完全去除[4]。大豆7S球蛋白約占大豆總可溶性蛋白的1/3，其主要由β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和堿性7S球蛋白組成，是大豆中的主要抗原蛋白，會引起斷奶仔豬等幼齡動物免疫功能紊亂和腸道損傷[5-6]，進而影響其生長性能。大豆7S球蛋白引起的腸道損傷主要表現(xiàn)為腸黏膜形態(tài)損傷和屏障功能損傷，且大豆7S球蛋白與斷奶仔豬空腸中后段的結合能力最強[7]。本研究的對象IPEC-J2是首次于1989年從新生仔豬空腸中段分離出的非轉化柱狀上皮細胞系[8]，是用于體外研究豬腸道相關性疾病/營養(yǎng)代謝的主要對象。

維生素A(vitamin A，VA)是動物機體所必需的脂溶性維生素，對多種上皮細胞的生長分化具有調(diào)節(jié)作用；同時，還能發(fā)揮抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，是維持黏膜上皮屏障完整性的重要因子[9]。機體(尤其是兒童)VA狀態(tài)與腹瀉類疾病的發(fā)生有密切關系，補充一定劑量的VA對腹瀉類疾病具有預防和輔助治療的效果[10]。研究已證實，VA對脂多糖(LPS)誘導的腸上皮細胞損傷具有保護作用[11]。

本研究以IPEC-J2為研究對象，以大豆7S球蛋白作為誘導因素，從細胞活力、細胞跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance，TEER)、熒光素鈉滲透性、細胞膜完整性與緊密連接蛋白基因表達幾個方面探究VA對大豆7S球蛋白致IPEC-J2細胞屏障功能損傷的影響，為VA能否用于防治斷奶仔豬蛋白營養(yǎng)性腹瀉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆7S球蛋白由中國農(nóng)業(yè)大學食品工程學院郭順堂教授提供(專利號：CN200410029589.4，純度為86.9%)；IPEC-J2由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院徐志文教授惠贈；VA、熒光素鈉購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM F/12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；澳洲胎牛血清、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、二胺氧化酶(DAO)、腸型脂肪酸結合蛋白1(IFABP1)的ELISA檢測試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；24孔Transwell細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；細胞跨膜電阻儀購自美國Merck Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組

試驗共分為9組：對照組(control)、7S(5 mg·mL-17S)、7S+A1(5 mg·mL-17S+0.01 μmol·L-1VA)、7S+A2(5 mg·mL-17S+0.1 μmol·L-1VA)、7S+A3(5 mg·mL-17S+1 μmol·L-1VA)、7S+A4(5 mg·mL-17S+ 10 μmol·L-1VA)、7S+A5(5 mg·mL-17S+100 μmol·L-1VA)、7S+A6(5 mg·mL-17S+1 000 μmol·L-1VA)、7S+A7(5 mg·mL-17S+10 000 μmol·L-1VA)。除檢測細胞活力每組設置6個重復外，其余指標每組設置3個重復。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力

將對數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔5×103個的密度接種至96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后按分組分別加入對應濃度的處理物，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度(D值)。

1.2.3 細胞跨膜電阻檢測

將對數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔2×104個的密度接種于24孔Transwell培養(yǎng)板(直徑6.5 mm，孔徑0.4 μm，面積0.33 cm2)上層，第1星期隔天換液，之后每天換液，并于換液之前檢測TEER，直至TEER穩(wěn)定，說明IPEC-J2融合至單層。阻值穩(wěn)定后，按分組分別加入相應濃度的處理物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行TEER測定。TEER=(實測值-空白值)×有效膜面積。

1.2.4 熒光素鈉滲透率檢測

在1.2.3節(jié)測完TEER之后，吸去培養(yǎng)液，使用37 ℃預熱的D-Hanks緩沖液清洗細胞3次，向Transwell上層加入200 μL含60 μg·L-1熒光素鈉的D-Hanks溶液，下層加入700 μL D-Hanks溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸取下層溶液檢測490 nm波長下的吸光值，根據(jù)標準曲線計算熒光素鈉濃度，再計算熒光素鈉滲透率。熒光素鈉滲透率(%)=(下層熒光素鈉濃度×700)/(60×200)×100。

1.2.5 細胞膜完整性相關指標含量檢測

將對數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔1×105個的密度接種至6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后按分組分別加入對應濃度的處理物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上層細胞培養(yǎng)液離心去沉淀，按照ELISA試劑盒說明書檢測ALP、LDH、DAO、IFABP1的含量。

1.2.6熒光定量PCR檢測ZO-1、Claudin-1和Occludin基因表達情況

將1.2.5節(jié)的下層細胞按照Trizol法進行RNA提取，按照反轉錄試劑盒操作說明將RNA反轉錄成cDNA。以5倍稀釋的cDNA為模板，檢測ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達量，引物序列見表1。結果按2-ΔΔCt法進行計算。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0對試驗結果進行單因素方差分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。試驗結果用平均值±標準差表示，柱狀圖繪制軟件為GraphPad. Prism 8.0。

2 結果與分析

2.1 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2活力的影響

如圖1所示，與對照組相比，5 mg·mL-1的7S球蛋白導致IPEC-J2活力極顯著降低(P<0.01)。與單獨添加7S球蛋白組相比，0.1和1 μmol·L-1VA與7S同時添加組細胞活力極顯著(P<0.01)升高，10 000 μmol·L-1VA與7S同時添加組的IPEC-J2活力極顯著降低(P<0.01)。

柱形圖中無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2活力的影響Fig.1 Effect of VA on viability of IPEC-J2 injured by soybean 7S globulin

2.2 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2單層細胞TEER的影響

如圖2所示，隨著IPEC-J2在Transwell培養(yǎng)板里培養(yǎng)時間的延長，TEER呈逐漸升高的趨勢，在第18天后穩(wěn)定在500 Ω·cm-2以上，說明IPEC-J2融合成單層。

圖2 IPEC-J2的細胞跨膜電阻Fig.2 Trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2

如圖3所示，與對照組相比，5 mg·mL-17S球蛋白處理使IPEC-J2單層細胞的TEER極顯著(P<0.01)降低。0.1～10 μmol·L-1的VA與7S同時添加組的TEER顯著(P<0.01)高于7S單獨處理組，但10 000 μmol·L-1VA與7S同時添加組的TEER極顯著(P<0.01)降低。

圖3 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2單層細胞細胞跨膜電阻的作用Fig.3 Effect of VA on trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.3 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2單層細胞通透性的影響

對熒光素鈉滲透率的影響結果如圖4，與對照組相比，添加5 mg·mL-17S球蛋白導致IPEC-J2單層細胞對熒光素鈉的滲透率極顯著(P<0.01)升高。0.01～10 μmol·L-1VA與7S同時添加組的熒光素鈉滲透率極顯著(P<0.01)低于7S單獨處理組；1 000和10 000 μmol·L-1VA與7S同時添加組熒光素鈉滲透率極顯著(P<0.01)高于7S單獨處理組。

圖4 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2單層細胞熒光素鈉滲透率的影響Fig.4 Effect of VA on permeability of sodium fluorescein of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.4 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2細胞膜完整性的影響

VA對大豆7S球蛋白破壞IPEC-J2細胞膜完整性相關指標的影響見圖5。單獨添加5 mg·mL-17S球蛋白導致細胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量極顯著(P<0.01)升高。0.01 μmol·L-1VA與7S同時添加組的ALP、LDH和DAO含量與7S單獨處理組差異不顯著，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時添加組的ALP、LDH和DAO含量均顯著(P<0.05或0.01)低于7S單獨處理組；0.01～10 μmol·L-1VA與7S同時添加組的IFABP1含量均顯著(P<0.05或0.01)低于7S單獨處理組；而10 000 μmol·L-1VA與7S同時添加組的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量則顯著(P<0.05或0.01)高于7S單獨處理組。

圖5 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of VA on destruction of IPEC-J2 integrity by soybean 7S globulin

2.5 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2緊密連接蛋白基因表達的影響

如圖6所示，單獨添加5 mg·mL-17S球蛋白導致IPEC-J2緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)降低。由圖6-a可知，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時添加組的ZO-1 mRNA表達量極顯著高于7S單獨處理組(P<0.01)，而10 000 μmol·L-1VA與7S同時添加組導致ZO-1 mRNA表達量極顯著(P<0.01)低于7S單獨處理組。由圖6-b可知，0.1和1 μmol·L-1VA與7S同時添加組的Claudin-1 mRNA表達量顯著(P<0.05)高于7S單獨處理組。由圖6-c可知，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時添加組的OccludinmRNA表達量顯著(P<0.05或0.01)高于7S單獨處理組。

圖6 大豆7S球蛋白誘導下VA對IPEC-J2緊密連接蛋白基因表達的影響Fig.6 Effect of VA on expression of tight junction protein genes in IPEC-J2 induced by soybean 7S globulin

3 討論

3.1 大豆7S球蛋白對IPEC-J2細胞屏障功能的損傷作用

作為大豆中的主要致敏蛋白，大豆7S球蛋白主要危害斷奶仔豬的腸道健康進而影響其生長性能。體外試驗表明，大豆7S球蛋白主要抑制仔豬腸上皮細胞的體外增殖、誘導腸上皮細胞凋亡和自噬進而導致其活性下降，還會破壞腸上皮細胞的完整性，抑制緊密連接蛋白的表達，導致體外腸上皮細胞模型的通透性升高，且7S球蛋白濃度越高，作用時間越長，影響越顯著[12-15]。本試驗參考彭成璐等[16]的研究，用5 mg·mL-17S球蛋白作為誘導因素處理IPEC-J2 24 h，進行細胞損傷模型的構建。試驗結果表明，5 mg·mL-1的7S球蛋白處理24 h使IPEC-J2的細胞活力極顯著降低，與前人研究結果一致。

腸黏膜機械屏障主要由腸上皮細胞和細胞間的連接復合物組成，因此，腸上皮細胞的完整性和細胞間連接的狀態(tài)是影響腸黏膜機械屏障通透性的主要因素。TEER是用于評價上皮屏障通透性和完整性的重要指標，其值越大說明屏障通透性越低。LDH是細胞內(nèi)酶，ALP是細胞膜的標志性酶，當細胞受到損傷、細胞膜完整性被破壞時會釋放，因此，細胞培養(yǎng)液中的LDH和ALP含量(或活性)是普遍用來評價細胞膜完整性的重要指標[17]。而DAO和IFABP1是腸上皮細胞的胞內(nèi)蛋白，具有很高的組織特異性，只有當腸上皮細胞受損時才會釋放到細胞外，其在血液中的含量是臨床上用來監(jiān)測腸黏膜屏障通透性的特異性指標[18]。因此，腸上皮細胞培養(yǎng)液中的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量能間接反映細胞膜的完整性。緊密連接復合物是維持腸黏膜機械屏障的重要結構，其中，Claudins是腸黏膜上皮選擇性屏障的主要結構蛋白；Occludin是維持腸黏膜上皮細胞間通透性的主要功能蛋白；ZOs與細胞骨架蛋白形成廣泛連接，在細胞間連接的形成、結構和功能變化中起重要的作用[19]。賈剛等[12]研究表明，7S球蛋白導致仔豬腸上皮細胞IECs完整性破壞，LDH和ALP的釋放增加。Zhao等[13]研究表明，7S球蛋白導致IPEC-J2的ALP釋放增加，Occludin和ZO-1的mRNA表達量降低，TEER降低。Peng等[15]也發(fā)現(xiàn)，7S球蛋白能通過下調(diào)Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達破壞IPEC-J2的細胞骨架。以上研究表明，7S球蛋白會通過破壞腸上皮細胞的完整性，以及抑制緊密連接蛋白的表達導致腸上皮細胞屏障通透性升高；本研究中5 mg·mL-17S球蛋白導致IPEC-J2單層細胞TEER極顯著降低，熒光素鈉滲透率極顯著升高，細胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量極顯著升高，ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達量極顯著下調(diào)，與前人研究結果相符。

3.2 VA對大豆7S球蛋白致IPEC-J2細胞屏障功能損傷的作用

VA是動物必需的脂溶性維生素，具有調(diào)節(jié)細胞增殖分化、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等生物功能。給正常動物機體添加一定水平的VA能夠促進腸道發(fā)育，使腸隱窩變淺、絨毛增高，但過高水平的VA反而會抑制腸道發(fā)育[20]。添加VA會導致體外培養(yǎng)的腸上皮細胞增殖數(shù)量減少[21]，但促進了腸上皮細胞的分化[22]。以上研究表明，VA通過抑制腸上皮細胞增殖、增強腸上皮細胞分化來促進腸道生長發(fā)育。但當腸道受到損傷時，補充VA能在短時間內(nèi)極顯著促進腸黏膜細胞的增殖[23]。關于VA對體外腸上皮細胞活力損傷發(fā)揮保護作用的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，0.01～10 μmol·L-1VA能緩解7S對IPEC-J2活力的損傷，且0.1和1 μmol·L-1VA效果較好。p38/JNK MAKP信號通路介導的細胞凋亡是7S球蛋白損傷IPEC-J2活力的主要因素[16]，VA能通過降低JNK磷酸化水平對糖基化終末產(chǎn)物誘導的角膜上皮細胞損傷發(fā)揮保護作用[24]，因此，推測VA也可能通過影響JNK MAKP信號通路對7S損傷IPEC-J2活力發(fā)揮保護作用。且本研究發(fā)現(xiàn)，10 000 μmol·L-1VA導致IPEC-J2活力進一步降低，說明添加高濃度VA反而會損傷腸上皮細胞。

VA能通過促進腸細胞增殖、抑制凋亡來維持腸黏膜的屏障功能[25]。體內(nèi)試驗證明，給乳糖誘導的腹瀉大鼠補充VA，能顯著降低血清中DAO和Zonulin蛋白的含量，且顯著上調(diào)小腸Claudin-1和Occludin的表達[26]，提前補充VA也能緩解LPS導致的小鼠腸道ZO-1、Occludin和Claudin-1表達降低的情況[27]。Baltes等[22]發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)液中添加VA能通過促進Claudin-2的表達，增強Caco2單層細胞屏障的完整性，導致其對甘露醇的通透性降低，TEER升高。Yamada等[28]研究發(fā)現(xiàn)，添加VA能促進ZO-1的表達，進而增強誘導性多功能干細胞衍生的腸道類器官的屏障功能。He等[11]發(fā)現(xiàn)，補充VA能夠緩解LPS下調(diào)IPEC-J2的ZO-1、Occludin、Claudin-1表達的作用，從而保護IPEC-J2單層細胞的屏障功能。以上研究表明，補充VA能通過影響緊密連接蛋白的表達對腸上皮細胞的屏障功能發(fā)揮增強和保護作用。本試驗結果表明，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時添加極顯著緩解了7S導致的IPEC-J2單層細胞TEER降低、熒光素鈉通透性升高的情況，也極顯著降低了細胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1的含量，0.1和1 μmol·L-1VA同時顯著緩解了7S導致的IPEC-J2中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達下調(diào)。說明一定劑量的VA能影響IPEC-J2完整性和緊密連接蛋白的mRNA表達，從而緩解7S導致的IPEC-J2單層細胞通透性損傷。Jiang等[29]發(fā)現(xiàn)，VA缺乏會上調(diào)MLCK的表達，進而抑制魚腸道黏膜中緊密連接復合物的表達，說明VA影響緊密連接蛋白表達的機制可能與MLCK信號通路有關，但還需進一步研究證實。本研究發(fā)現(xiàn)10 000 μmol·L-1VA會加重7S球蛋白對IPEC-J2單層細胞通透性的損傷，這可能是由于過量VA導致了脂質(zhì)過氧化[30]，進而損傷了IPEC-J2的細胞活力。

4 結論

IPEC-J2培養(yǎng)液中同時添加VA與大豆7S球蛋白，0.1～10 μmol·L-1VA能通過保護細胞活力和細胞完整性，影響緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達對大豆7S球蛋白導致的IPEC-J2細胞屏障功能損傷發(fā)揮保護作用，10 000 μmol·L-1VA會加重這種損傷。