林靜霞, 張芳菲, 張澤喬, 鐘遠(yuǎn)秋, 陳永鋒
南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091
銀屑病(psoriasis)是一種有遺傳背景的由免疫異常介導(dǎo)的慢性紅斑鱗屑性皮膚病[1],主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)激活引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化[2],目前其發(fā)病機(jī)制研究仍不完善。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明,大量的易感基因座位于人類基因組的非編碼區(qū)[3],表明非編碼區(qū)在銀屑病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類新的具有調(diào)控功能的RNA,可參與包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育和免疫反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)過程[4],在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平等多方面影響疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。目前基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的差異表達(dá)研究,利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA),可發(fā)現(xiàn)大量lncRNA在銀屑病患者皮損組織中異常表達(dá),并可能作為銀屑病的新易感位點(diǎn)[6]。lncRNA在調(diào)控銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵通路中發(fā)揮著重要作用,具有潛在的研究意義[7]。因此,本研究通過分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集,探討細(xì)胞周期的lncRNA異常與銀屑病發(fā)病的關(guān)系,為進(jìn)一步揭示lncRNA在銀屑病細(xì)胞周期中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
1.1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究分析數(shù)據(jù)均來源于GEO數(shù)據(jù)庫,包括兩個數(shù)據(jù)集GSE54456和GSE63979,其中正常對照組90個,銀屑病皮損組99個,共189個樣本。
1.1.2 試劑和儀器 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Thermo Fisher),PBS緩沖液(Thermo Fisher),胰酶(Thermo Fisher),siRNA(銳博生物),轉(zhuǎn)染試劑盒(銳博生物),細(xì)胞周期試劑盒(聯(lián)科生物)。生物安全柜(新加坡ESCO公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司),離心機(jī)(Thermo),流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。
1.2.1 信號通路富集分析 通過DEseq2分析來自GEO數(shù)據(jù)庫的銀屑病皮損組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集,篩選銀屑病組與健康對照組差異表達(dá)的基因。篩選條件為log2FC絕對值>2、P<0.05,并構(gòu)建基因表達(dá)矩陣[8]。采用DAVID功能注釋對在銀屑病中差異表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行基因功能富集分析,KEGG信號通路設(shè)定P<0.05,并采用GSEA 軟件包進(jìn)行分析[9]。
1.2.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 利用WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[10],去除弱共表達(dá)基因?qū)Γ徑娱撝蹈哂?.02,并與至少一個lncRNA分子相互作用,形成lncRNA-蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[11]。
1.2.3 siRNA干擾 將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)至30%~50%的濃度,然后用50 nM siRNA轉(zhuǎn)染48 h。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 將HaCaT細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)至30%~50%的濃度,然后轉(zhuǎn)染siRNA 48 h。收集細(xì)胞,用PBS緩沖液洗滌,在4 ℃的70%乙醇中固定過夜。在37 ℃下用RNase A去除RNA 30 min。最后,在室溫下用碘化丙啶(PI)染色30 min,并在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。siRNA干擾LINC01206的HaCaT細(xì)胞與對照組HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期中G0/G1期、G2/M期和S期等的細(xì)胞數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
通過整合分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與健康對照組的差異表達(dá)基因,篩選出1 319個在銀屑病中差異表達(dá)上調(diào)的基因(圖1A)。對銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析,表明其主要富集在趨化因子信號通路以及細(xì)胞周期通路等(圖1B)?;蚣细患治鼋Y(jié)果顯示,銀屑病皮損中細(xì)胞周期通路表達(dá)升高,且P<0.01(圖1C),說明銀屑病中存在細(xì)胞周期的失調(diào)。
圖1 細(xì)胞周期的失調(diào)與銀屑病有關(guān) 1A:銀屑病差異表達(dá)基因火山圖;1B:銀屑病中表達(dá)上調(diào)基因KEGG信號通路富集分析;1C: 在GSEA基因集合富集分析中,細(xì)胞周期通路信號升高
篩選與銀屑病細(xì)胞周期通路相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA(圖2A),利用WGCNA構(gòu)建lncRNA與蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示在細(xì)胞周期通路中,有9個 lncRNA與14個蛋白編碼基因有關(guān)聯(lián)(圖2B)。通過提取細(xì)胞周期相關(guān)lncRNA在對照組及銀屑病皮損組的表達(dá)量,分析結(jié)果顯示LINC01206在銀屑病皮損組織中表達(dá)倍數(shù)最高,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。結(jié)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明,LINC01206可通過與細(xì)胞周期通路中的關(guān)鍵基因CCNB1和CCNE1等的相互作用參與銀屑病進(jìn)程。
表1 細(xì)胞周期通路相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA
圖2 lncRNA參與銀屑病細(xì)胞周期進(jìn)程 2A:熱圖顯示對照組與銀屑病皮損中與細(xì)胞周期通路有關(guān)聯(lián)的lncRNA的差異表達(dá)情況;2B:加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建細(xì)胞周期通路中l(wèi)ncRNA與蛋白編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
通過在HaCaT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染50 nM siRNA干擾LINC01206的表達(dá),并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)48 h后HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示siRNA敲低HaCaT細(xì)胞中LINC01206的表達(dá),會引起細(xì)胞周期G2/M期的阻滯(圖3A~3C),提示lncRNA可以調(diào)控HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期過程。
圖3 siRNA敲低LINC01206的表達(dá)引起細(xì)胞周期G2/M期的阻滯 3A、3B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組(3A)及siRNA干擾LINC01206組(3B)的HaCaT細(xì)胞周期;3C: 細(xì)胞周期各時期細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)
lncRNA參與了從基因表達(dá)到蛋白質(zhì)翻譯和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定等細(xì)胞生命過程,在發(fā)育、機(jī)體內(nèi)平衡和維持細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮重要作用[4]。本研究結(jié)果證實(shí)了lncRNA失調(diào)與多種細(xì)胞信號通路相關(guān),并在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析研究表明,銀屑病病變與免疫反應(yīng)、細(xì)胞角質(zhì)化及細(xì)胞周期等多種途徑有關(guān)[13]。細(xì)胞周期對于細(xì)胞生命過程至關(guān)重要,其參與分裂細(xì)胞中的增殖、分化和凋亡[14]。細(xì)胞的正常分裂依賴于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期階段時間順序的檢查點(diǎn),包括 G1/S、G2/M和中期/后期轉(zhuǎn)變[15]。目前已有多項(xiàng)研究表明,lncRNA通過多種途徑參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控[16]。如lncRNA DLEU2通過抑制p53表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制Notch信號通路的活性,從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[17];而lncRNA PLAC2可通過抑制STAT1核轉(zhuǎn)移降低RP36表達(dá),從而阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的細(xì)胞周期進(jìn)程[18]。同時也有研究顯示,通過敲低lncRNA MIR31HG可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞G2/M期的細(xì)胞周期停滯,影響細(xì)胞增殖[19]。這提示lncRNA可通過調(diào)控銀屑病細(xì)胞周期來發(fā)揮功能。
本研究通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),銀屑病上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期通路中;lncRNA與細(xì)胞周期蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示,LINC01206、LINC01269、LINC01215和LINC02159等通過與細(xì)胞周期信號通路關(guān)鍵基因CCNA2、CCNB1和CCNE1的相互作用調(diào)控銀屑病進(jìn)程。表明lncRNA可能通過與RNA結(jié)合蛋白相互作用來參與銀屑病細(xì)胞周期的調(diào)控[20]。同時,lncRNA與蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示,LINC01206通過作用于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)基因CCNB1和CCNE1來調(diào)控銀屑病進(jìn)程。為深入了解lncRNA在銀屑病細(xì)胞周期中的功能,本研究通過小干擾RNA在HaCaT細(xì)胞中敲低細(xì)胞周期通路中差異表達(dá)最明顯的LINC01206,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程,結(jié)果顯示,LINC01206表達(dá)的降低將引起HaCaT細(xì)胞周期G2/M期的阻滯,表明lncRNA可能通過介導(dǎo)HaCaT細(xì)胞周期、調(diào)控細(xì)胞生命過程參與銀屑病發(fā)病。
綜上所述,銀屑病病變引起lncRNA的差異表達(dá),而lncRNA的表達(dá)變化能夠作用于細(xì)胞周期,并導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的失調(diào),從而影響銀屑病的進(jìn)程。因此,對銀屑病細(xì)胞周期中差異表達(dá)lncRNA的研究,將有助于解釋銀屑病發(fā)病過程中角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的機(jī)制,為進(jìn)一步闡明lncRNA在銀屑病中的生物學(xué)功能以及在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用提供新的理論依據(jù),提示細(xì)胞周期中的lncRNA將有望成為銀屑病治療的新藥物靶點(diǎn)。