食品微生物檢測技術(shù)和方法研究進展

秦俊蓮，徐寧寧

(1.廣東中測食品化妝品安全評價中心有限公司，廣東中山 528437；2.廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東廣州 510070）

隨著國際食品經(jīng)濟和貿(mào)易的發(fā)展，食品安全問題受到社會的廣泛關(guān)注。食源性微生物引起的食品安全風險已成為全球性問題。國家食品安全調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年以來致病微生物導致的食物中毒事件數(shù)量一直多于化學性危害和有毒動植物造成的危害。在病因明確的食源性疾病暴發(fā)事件中，由微生物因素引起的發(fā)病人數(shù)最多，占總數(shù)的43.88%。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近十年，我國由食源性病原微生物引起的食品安全事故比例高達60%以上[1]。食源性疾病逐漸成為當今世界最突出的食品安全問題，而微生物污染存在于食品的加工、生產(chǎn)和流通等各個環(huán)節(jié)。微生物檢測在食品安全評價及質(zhì)量監(jiān)控方面發(fā)揮著重要作用，限定食品中微生物存在量的閾值，建立完善的微生物檢測體系是保障食品安全的重要措施[2]。

食品微生物檢測主要包括菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌3個方面的檢測。檢測人員對食品進行特殊處理，在特定環(huán)境下進行培養(yǎng)，測定待測指標。除益生菌以外，一般而言，食品中菌落總數(shù)越多，表示該食品受微生物污染程度越嚴重，食品安全性越差。大腸菌群包含腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯菌屬，屬于能產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌類，這些細菌寄居于人或者溫血動物腸道內(nèi)，可隨大便排出寄主體外，食物受糞便污染的程度用大腸菌群系數(shù)表示。致病菌是指可導致人們產(chǎn)生疾病的細菌類群，根據(jù)現(xiàn)行有效的食品安全國家標準，致病菌主要指腸道致病菌和致病性球菌，主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，食品安全標準要求食品中致病菌不得檢出。在實際檢測工作中，如大腸菌群檢測結(jié)果呈陽性，則該食品受到致病菌污染可能性增加，可進行致病菌指標檢測[3]，另外根據(jù)長期檢測經(jīng)驗和特定產(chǎn)品類型也可直接進行某項致病菌檢測，如水產(chǎn)品的副溶血性弧菌。根據(jù)檢測需要，運用微生物學的理論與技術(shù)，檢測食品中可能存在的微生物的種類、數(shù)量等，以判別食品是否符合國家食品安全質(zhì)量標準的過程為食品微生物檢測，其主要方法如下。

1 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)檢測方法是基于微生物形態(tài)學和培養(yǎng)特性為評價標準的方法。長期以來，傳統(tǒng)食品微生物檢測一直遵循增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學和生化、血清學鑒定的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)檢測方法準確性和靈敏度較高，但檢測流程繁雜、檢測時間長、準備和收尾工作繁重、效率不高等問題突出[2]，尤其是部分類別的食品保質(zhì)期短，采用傳統(tǒng)檢測方法，嚴重影響和制約了食品在市場上的銷售及流通。此外，傳統(tǒng)檢測方法無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進行檢測。隨著儀器自動化、分子生物學等分析技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)、應(yīng)用并推廣準確高效的食品微生物檢測方法是食品安全檢測的重要目標之一。

2 改進后的培養(yǎng)檢測法

基于傳統(tǒng)檢測方法，對培養(yǎng)基成分進行改良，在培養(yǎng)過程中加入指示劑、顯色劑、抑菌劑、熒光物質(zhì)等來完善培養(yǎng)，可提高培養(yǎng)基的特異性增菌或分離效果。對培養(yǎng)基的使用便利性進行升級改進，如快速檢測紙片、集成化生化鑒定試劑條及儀器自動化技術(shù)在食品微生物檢測方面具有顯著優(yōu)點。

3 代謝技術(shù)法

在微生物生長過程中，可根據(jù)代謝產(chǎn)物變化、生物電阻抗等特征開展微生物檢測工作，達到食品微生物安全檢測目的。利用定量細菌生長過程中釋放的熱量變化，以對微生物定量和定性的技術(shù)稱為微熱量技術(shù)。此外，隨著代謝組學研究技術(shù)的發(fā)展和微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫的建立，食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析已被建議作為臨床和食品中致病菌鑒別的替代方法[4]。

4 生物傳感器法

生物傳感是指對生物活性物的理化性質(zhì)變化產(chǎn)生感應(yīng)，它通過物理、化學換能器捕捉目標物與敏感元件之間的反應(yīng)，然后將反應(yīng)的程度用不連續(xù)或連續(xù)的數(shù)字電信號呈現(xiàn)出來，從而得出目標物質(zhì)的濃度。生物傳感器法主要有光學傳感器、生物發(fā)光傳感器和壓電免疫傳感器三種。光學傳感器適用于檢測能產(chǎn)生熒光素的細菌，但靈敏度不高。生物發(fā)光傳感法特異性好，可區(qū)分活菌體和死菌體，但檢測耗時較長。壓電免疫傳感器有利于進行生命體活動的研究，因此成為生物傳感器的研究熱點之一。

5 免疫學技術(shù)法

利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過病原體的催化作用形成免疫球蛋白，可實現(xiàn)對食品微生物的免疫學檢測。目前，免疫學技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌和彎曲桿菌等病原菌。免疫技術(shù)主要包括免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫法和免疫磁珠。免疫層析是根據(jù)免疫抗體-抗原的相互吸附原理設(shè)計出的一種制備收集或檢測分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫法是一種固相免疫測定技術(shù)，依據(jù)抗原抗體的特異性，并結(jié)合酶的作用，明確微生物的數(shù)量，具有靈敏度高、特異性強、方便快捷等特點，廣泛應(yīng)用于多細菌檢測。免疫磁珠捕獲法是通過免疫磁珠對目標微生物進行針對性的富集，提高傳統(tǒng)方法的敏感性。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》（GB 4789.1—2016）已將免疫磁珠捕獲法作為檢驗大腸桿菌O157:H7的推薦方法。

6 分子生物學方法

隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）成為食品微生物檢測常用的分子生物學技術(shù)之一。在食品微生物檢測技術(shù)中，以具有高度保守的核酸序列為對象設(shè)計特異引物進行擴增，通常為16S rRNA基因的高變異片段，進行實時熒光定量或者凝膠電泳聯(lián)合紫外核酸檢測儀觀察擴增結(jié)果，已到達最終檢測食品中是否有某種致病菌的存在。在多種分子生物學手段中，依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)、定量PCR技術(shù)、基因探針技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均得以廣泛應(yīng)用。此外，還有基于等溫擴增技術(shù)的環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）法、NASBA法等也被應(yīng)用到食品微生物檢測技術(shù)中。

6.1 DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜技術(shù)是基于改進的PCR技術(shù)，將目標微生物的核酸進行擴增，產(chǎn)生多條特異性與非特異性的DNA擴增片段，而后通過微生物的特有條帶進行區(qū)別鑒定。DNA指紋圖譜技術(shù)主要包括隨機引物擴增DNA多態(tài)性（RAPD）技術(shù)和基因內(nèi)重復性一致序列（ERIC）擴增技術(shù)。

6.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在同一個反應(yīng)體系中同時加入多對特異性引物，如樣品中存在與各引物特異性互補的片段，即可同時擴增，實現(xiàn)一次擴增檢測多種致病菌的目的。該方法適用于同時需要檢測多個目標菌的樣品，可大大提高檢測效率。

6.3 定量PCR檢測技術(shù)

定量PCR檢測技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入標記物，通過標記物的量變化或熒光強度變化，同時實現(xiàn)定性定量。應(yīng)用較廣泛的技術(shù)包括內(nèi)標定量PCR和實時熒光定量PCR。在PCR反應(yīng)管中加入內(nèi)標物，可消除PCR擴增過程中不同反應(yīng)體系間以及標本間存在的差異與干擾，因此，選擇合適的標記物是內(nèi)標定量PCR方法的關(guān)鍵點之一。實時熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累變化實時監(jiān)測整個PCR進程的手段，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。RUDI等[5]采用實時定量PCR技術(shù)，快速檢測出了食品樣品中的單核增生李斯特氏菌。此外，其他研究者還利用PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫法相結(jié)合，快速測定了食品中的大腸桿菌和沙門氏菌。

6.4 基因探針檢測方法

每一種生物都有獨特的核酸片段，病原微生物也有其特定DNA片段，通過分離和標記這些片段可制備出探針?；蛱结樇夹g(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品安全微生物檢測中，可靈敏、快速、直接的檢測出樣品中的特定目標微生物，而不受其他微生物類群存在的干擾。目前，市面上已有多種商品化的基因探針試劑盒出品，如美國Gene-Trak公司開發(fā)的利用特異的基因探針對單增李斯特氏菌、沙門氏菌、和大腸桿菌的16S rRNA進行檢測的脫氧核糖核酸雜交篩選比色法試劑盒。

6.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將大量已按檢測要求制作好的探針固化，通過一次雜交同時檢測多種靶基因的技術(shù)，是目前檢測食品中有害微生物最有效最高效的手段之一。通過設(shè)計通用引物擴增細菌16S rRNA，然后將擴增產(chǎn)物與含有探針的芯片進行雜交，在短時間內(nèi)即可鑒定出大腸桿菌（3～4 h）、沙門氏菌和葡萄球菌等致病性微生物。KIM等[6]采用比較基因組學技術(shù)，針對11種常見的食物源性致病微生物設(shè)計出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準確地檢測出食品中的致病性微生物。

7 展望

隨著微生物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測方法也越來越多樣化。食品微生物檢測技術(shù)將會向自動化、快速化、靈敏度高、特異性強、重復性好以及簡易、經(jīng)濟的方向不斷發(fā)展。每一種檢測方法都有優(yōu)點和缺點，為提高準確性，在食品檢測時可根據(jù)實際情況選擇合適的方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合使用，不斷提高檢測的準確度，確保食品在制作、生產(chǎn)、包裝和運輸?shù)让總€環(huán)節(jié)中的質(zhì)量安全。此外，檢驗人員在食品微生物檢測中發(fā)揮著主導作用，要加強其對檢測技術(shù)、流程和標準的掌握程度，將理論和實踐緊密結(jié)合，從而獲得精準的檢測結(jié)果。

微生物污染存在于食品工業(yè)生產(chǎn)銷售的整個過程，微生物種類繁多且容易變異，污染情況和分布規(guī)律復雜，檢測技術(shù)相對落后和控制機理研究缺乏等諸多原因為食品微生物檢測造成諸多困境。因此，不斷加強我國食品微生物風險分析能力和微生物定量風險評估，以減少與發(fā)達國家的差距，切實保障糧食的質(zhì)量安全，維護人們的根本利益，勢在必行。建立食品微生物安全風險數(shù)據(jù)庫是保障食品安全的基礎(chǔ)手段之一，此數(shù)據(jù)庫包括數(shù)據(jù)中心與資源共享平臺、綜合評價指標體系、綜合評價指數(shù)模型和風險預(yù)警模型四大關(guān)鍵平臺，其中綜合評價指標體系由微生物菌種資源庫、微生物檢測項目庫、微生物檢測方法庫、危害物質(zhì)信息庫、微生物安全國際標準指標庫構(gòu)成。通過數(shù)據(jù)庫掌握了7大類食品的致病微生物污染率及污染水平，為微生物安全研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和菌種資源，對我國建設(shè)高水平、高質(zhì)量的食品安全保障體系具有重要意義。綜上所述，食品安全關(guān)系國計民生，隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，食品微生物檢測方法和體系將不斷完善，廣大科研工作者需要共同努力，不斷改進和豐富現(xiàn)有的檢測技術(shù)，研發(fā)開創(chuàng)新的檢測方法，為食品安全保駕護航。