食源性病原菌的常見類型及檢測(cè)技術(shù)

許文蓓

（九江市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心食品分中心，江西九江 332000）

當(dāng)前，食源性病原菌的預(yù)防和控制已引起全球關(guān)注。食源性病原菌是引起食物中毒，或者以食品為媒介進(jìn)行傳播的一類致病菌，可以在入侵宿主后產(chǎn)生致病性，常見的有沙門氏菌、大腸桿菌、結(jié)核菌等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國在2015年共出現(xiàn)了3 181起食源性病原菌中毒事件，占食物中毒總例數(shù)的53.7%。多數(shù)情況下，食品中的病原菌濃度較低，傳統(tǒng)的檢測(cè)需要進(jìn)行多個(gè)步驟，如增菌、分離等，大概需要花費(fèi)4～7 d的時(shí)間，有一定的局限性[1]。隨著時(shí)代的不斷進(jìn)步，檢測(cè)方法越來越先進(jìn)，先后興起了PCR技術(shù)、免疫層析技術(shù)等，即便進(jìn)行選擇性的增菌培養(yǎng)后，快速檢測(cè)仍受到各種因素的影響。本文對(duì)食源性病原菌的常見類型及檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹，希望能夠?yàn)槭吃葱圆≡目焖贆z測(cè)提供參考。

1 食源性病原菌

所謂食源性病原菌，是指在食品加工、流通過程中引入的病原菌。位于食品中的病原菌，經(jīng)過一段時(shí)間的生長(zhǎng)，會(huì)使食品出現(xiàn)變質(zhì)、受損的情況。同時(shí)，含有有毒物質(zhì)的病原菌，還會(huì)使人們患病。

基于食源性病原菌的危害分析，多數(shù)情況下會(huì)引起急性中毒，輕者表現(xiàn)為急性胃腸炎，重者出現(xiàn)循環(huán)、呼吸等系統(tǒng)癥狀。有部分變質(zhì)食品中含有少量的有毒物質(zhì)，或由于本身毒性作用的特點(diǎn)，并不會(huì)引起急性中毒，但是長(zhǎng)時(shí)間食用，會(huì)造成慢性中毒，甚至表現(xiàn)為致突變、致畸、致癌的作用。食用霉變、腐敗的食物，不僅會(huì)引起急性中毒，而且還有嚴(yán)重的潛在危害。近幾年，伴隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，食源性疾病事件發(fā)生率持續(xù)上漲，食源性疾病也成為世界廣泛關(guān)注的一個(gè)公共衛(wèi)生問題，面對(duì)如此嚴(yán)峻的食品安全問題，全世界對(duì)于食品中病原菌的檢測(cè)越來越重視，并出臺(tái)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來保障食品安全[2]。更重要的是，提出在食品生產(chǎn)、加工、流通等環(huán)節(jié)強(qiáng)化對(duì)食源性病原菌的檢測(cè)。

2 常見的幾種食源性病原菌

2.1 沙門氏菌

沙門氏菌是一種無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性直桿菌，有菌毛，血清型多。目前，全球共發(fā)現(xiàn)血清型2 523個(gè)，我國有300個(gè)，均會(huì)引發(fā)食源性疾病，癥狀常于感染12～72 h后出現(xiàn)，表現(xiàn)為腹痛、頭痛、發(fā)燒、嘔吐等。

2.2 致病性大腸埃希菌

大腸埃希氏菌是一種無芽孢、可以運(yùn)動(dòng)，有鞭毛的革蘭陰性桿菌，分為多種類型，比如腸出血性大腸埃希氏菌、擴(kuò)散粘附性大腸埃希氏菌等，其中腸出血性大腸埃希氏菌（0157∶H7）最為常見，其引發(fā)的腸道疾病多表現(xiàn)為出血性腹瀉。對(duì)于此種病原菌，雖然國家明確規(guī)定：食品中不能檢出大腸桿菌0157∶H7，但其污染已成為國際性問題，應(yīng)引起高度重視。

2.3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，有16個(gè)血清型，其中8個(gè)血清型是有致病特性的病原菌。報(bào)告顯示，此類病原菌是人畜共患病的病原菌，可引起動(dòng)物、人的敗血癥、腦膜炎等疾病，致死率高達(dá)20%～70%[3]。

2.4 志賀氏菌

志賀氏菌是一種無鞭毛、無莢膜的兼性厭氧菌，基于血清學(xué)分型分為福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌等4個(gè)種群。

2.5 溶血性鏈球菌

溶血性鏈球菌呈現(xiàn)橢圓形或球形，對(duì)營養(yǎng)有著很高的要求。基于鏈球菌經(jīng)血液培養(yǎng)后是否出現(xiàn)溶血，及溶血性質(zhì)等情況，通常分為3種類型。人體受溶血性鏈球菌感染后，會(huì)引起皮膚化膿性炎癥、新生兒敗血癥、呼吸道感染等反應(yīng)。

2.6 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是一種無芽孢、無鞭毛的需氧或兼性厭氧菌，當(dāng)人感染此類病原菌后，會(huì)出現(xiàn)胃腸道癥狀，表現(xiàn)為嘔吐、惡心、血性腹瀉等，重者出現(xiàn)局部化膿感染，甚至出現(xiàn)全身性感染。近年來，金黃色葡萄球菌污染已成為國際性的衛(wèi)生問題，美國疾控中心表明，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占全部細(xì)菌性食物中毒的第2位。2005—2009年，我國每年都會(huì)發(fā)生由其引發(fā)的食物中毒事件，例如，2009年9月某學(xué)校和周邊居民因食用受金黃色葡萄球菌感染的米粉，造成50多人中毒[4]。

3 食源性病原菌的檢測(cè)技術(shù)

3.1 傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

在食品微生物的檢測(cè)中，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可謂是“金標(biāo)準(zhǔn)”，在食源性病原菌的檢測(cè)中占據(jù)著重要地位?，F(xiàn)階段，國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中均有病原菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定要求，其技術(shù)原理是從食品中抽取部分待測(cè)樣品，通過細(xì)菌液培養(yǎng)，對(duì)菌落的形態(tài)進(jìn)行觀察，從中提取典型菌落進(jìn)行鏡檢、生化鑒定和分型（血清學(xué)）。伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，特異性強(qiáng)、靈敏度高的培養(yǎng)基被用于檢測(cè)中，提高了篩選效率。然而，由于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、步驟多，在突發(fā)性的衛(wèi)生事件中很難進(jìn)行高通量的檢測(cè)，更無法起到精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)和預(yù)防的效果。另外，對(duì)于個(gè)別食品加工中受損的致病菌、休眠菌而言，該技術(shù)會(huì)出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。

3.2 免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在標(biāo)記免疫技術(shù)中，免疫熒光標(biāo)記技術(shù)發(fā)展最早，其以熒光素為標(biāo)記抗體，根據(jù)熒光素檢測(cè)出來的熒光，在顯微鏡定位抗原，明確抗原性質(zhì)，同時(shí)借助定量技術(shù)對(duì)病原菌含量進(jìn)行測(cè)定。該技術(shù)集熒光光素、血清學(xué)的敏感性和特異性于一體，因此其具有速度快、敏感度高等優(yōu)勢(shì)。但也有缺點(diǎn)，即無法徹底解決非特異性的染色問題，檢測(cè)結(jié)果不客觀，技術(shù)程序復(fù)雜[5]。而且，對(duì)于有目標(biāo)菌的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況，因此很少在食源性病原菌的檢測(cè)中應(yīng)用。

3.3 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是當(dāng)前的一種新免疫學(xué)方法，其由磁珠磁性、免疫學(xué)特異性相結(jié)合的一種免疫學(xué)技術(shù)。通過包被于對(duì)磁珠表面的抗體、目標(biāo)物的相互結(jié)合，產(chǎn)生抗體和抗原復(fù)合物。在外力磁場(chǎng)的作用下，此類復(fù)合物會(huì)產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng)，促使目標(biāo)物、雜質(zhì)分離，從而達(dá)到富集、濃縮目標(biāo)物的效果。在磁珠富集技術(shù)中，不管是磁珠粒徑，亦或者其分散性，都會(huì)影響到磁珠對(duì)病原菌的富集效果。免疫磁珠分離技術(shù)包括裸磁珠、功能化磁珠兩種技術(shù)，其中功能化磁珠又分為無機(jī)材料修飾法、適配體修飾法和抗體修飾法，現(xiàn)以無機(jī)材料修飾法為例進(jìn)行介紹。

無機(jī)材料修飾法是指為磁珠表層覆蓋無機(jī)材料，為磁珠提供官能團(tuán)。受外力磁場(chǎng)影響，致病菌可以和官能團(tuán)偶聯(lián)而富集。曾有研究對(duì)磁珠表面進(jìn)行羧基修飾，以此吸附食品中的致病菌，比如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等。同時(shí)，借助PCR檢測(cè)對(duì)不同濃度下的混合菌液的磁珠吸附能力進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，果汁中的磁珠捕獲率為57%～66%，奶粉中的磁珠捕獲率為40%～54%，鴨肉中的磁珠捕獲率為44%～64%。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，羧基修飾后的磁珠在不同的環(huán)境下，都能夠富集目標(biāo)菌，為PCR檢測(cè)提供保障。因?yàn)闊o機(jī)材料在各領(lǐng)域都得以應(yīng)用，故而其比較容易獲取。但是，用于修飾用途的無機(jī)材料，其厚度、形態(tài)等相關(guān)要素，可能會(huì)給富集性能產(chǎn)生一定的影響?；诖耍x用的無機(jī)材料應(yīng)具備干擾物少、富集量大等性能?，F(xiàn)階段，通常會(huì)將免疫磁珠分離技術(shù)和其他技術(shù)結(jié)合，對(duì)食源性致病菌進(jìn)行精準(zhǔn)且快速的檢測(cè)，如免疫學(xué)技術(shù)、PCR技術(shù)等，既可以節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，又能高通量的篩檢樣品。伴隨著免疫磁珠分離技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)人員已研發(fā)了一些無需擴(kuò)增培養(yǎng)，就可以對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，能夠?qū)z測(cè)時(shí)間控制在3 h內(nèi)，真正實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)致病菌的目標(biāo)。

3.4 電泳技術(shù)

3.4.1 介電電泳

介電電泳技術(shù)源自電泳，是一種基于Max-well經(jīng)典電磁場(chǎng)理論的技術(shù)，主要原理是中性粒子在不均勻的電場(chǎng)受到電場(chǎng)力的影響，進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)。伴隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，介電電泳阻抗技術(shù)成為病原菌捕獲、檢測(cè)的有效技術(shù)。通過對(duì)懸浮液電場(chǎng)頻率、電導(dǎo)率的改變，電泳阻抗發(fā)生也隨之變化，可以真實(shí)反映病原菌的富集量。

3.4.2 毛細(xì)管凝膠電泳

毛細(xì)管凝膠電泳，是一種以毛細(xì)管為通道，直流電場(chǎng)（高壓）為驅(qū)動(dòng)力，有機(jī)結(jié)合毛細(xì)管、柱富集的技術(shù)。在直流電場(chǎng)的影響下，帶電粒子向相反的方向位移，由于其位移速度不同，可以對(duì)組分進(jìn)行分離，達(dá)到分離、富集目標(biāo)菌的效果。實(shí)踐證實(shí)，在目標(biāo)菌的分離中，毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速分離，可在數(shù)秒或幾十分鐘內(nèi)完成，而且需要的樣本也不大。但是，在靈敏度、結(jié)果方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

3.5 生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)，是一種由物理、生物、電子技術(shù)、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科組成的技術(shù)手段。生物傳感器由信號(hào)轉(zhuǎn)換元件、生物分子識(shí)別元件組成，其原理是待檢測(cè)物和分子識(shí)別元件結(jié)合后，產(chǎn)生的熱、光或復(fù)合物等，會(huì)經(jīng)由信號(hào)轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)為光、電信號(hào)，以此來進(jìn)行分析和檢測(cè)。生物傳感技術(shù)的應(yīng)用，可以快速檢出食品中濃度比較低的病原菌。目前，生物傳感技術(shù)已廣泛用于食源性致病菌的檢測(cè)中。曾有學(xué)者借助該技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌0157∶H7，不僅在10 min內(nèi)完成了檢測(cè)，且精度達(dá)10 CFU/mL。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是使用樣本量少、重復(fù)性好、靈敏度高。但是由于當(dāng)前尚處于研究階段，再加上檢測(cè)費(fèi)用高，推廣難度比較大。

3.6 微流控技術(shù)

3.6.1 光學(xué)檢測(cè)

有研究基于激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)微流控芯片系統(tǒng)，對(duì)4種病原菌進(jìn)行檢測(cè)，包括志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、溶血性弧菌，結(jié)果顯示檢測(cè)限菌為102CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.0%。該方法也可以用在人工接種食品中的多重PCR產(chǎn)物分析中。

3.6.2 電化學(xué)檢測(cè)

相較于光學(xué)檢測(cè)，電化學(xué)的作用不只體現(xiàn)在可移植性和微型化兩方面，更突出的是在檢測(cè)過程中，不會(huì)受樣品渾濁度的影響。有研究結(jié)合了3種技術(shù)，包括微流體、脲酶催化和電化學(xué)阻抗分子，采用“三明治”方法對(duì)李斯特氏菌進(jìn)行捕獲，借助微流控檢測(cè)芯片對(duì)李斯特氏菌的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在30 min內(nèi)，捕獲率為93.0%；1 h內(nèi)，李斯特氏菌檢出限為 1.6×102CFU/mL。

4 結(jié)語

總的來講，每種檢測(cè)技術(shù)都有優(yōu)缺點(diǎn)，但隨著各種學(xué)科的共同進(jìn)步與發(fā)展，聯(lián)合使用多種檢測(cè)技術(shù)勢(shì)必會(huì)提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，在食源性病原菌的控制、預(yù)防方面發(fā)揮重要作用。