雙水相體系在酶催化藥物合成中的研究進(jìn)展

林錦良，陳小芳，李友鳳

(遵義師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，貴州 遵義 563002)

1 引言

酶是生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)或核酸類催化劑，不改變反應(yīng)方向和反應(yīng)平衡時(shí)，可以改變化學(xué)反應(yīng)的速度[1]。它既可以在生物體內(nèi)發(fā)生作用，也可以脫離生物體，甚至在有機(jī)溶劑中起著催化作用。而且，酶具有高效性和專一性的特點(diǎn)，使其催化的反應(yīng)具有效率高，副產(chǎn)物少的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，酶的催化反應(yīng)可以發(fā)生在水溶液中、溫度適中(室溫)、pH值接近中性、離子濃度低和常壓等條件中發(fā)生，反應(yīng)條件溫和[2]。因此，酶工程被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域的研究，比如食品、制藥、環(huán)境、檢測(cè)、農(nóng)業(yè)等。近年來(lái)，隨著物質(zhì)生活的不斷改善，醫(yī)療健康引起了人們?cè)絹?lái)越多的重視[3]。在此背景下，人們開發(fā)了各種類型的藥物中間體和藥物的酶催化反應(yīng)。然而，如上所述，酶源于生物體內(nèi)，這意味著其一旦離開最佳反應(yīng)條件，優(yōu)勢(shì)將被部分抑制直至完全失效。所以，獲得耐受性強(qiáng)的酶和開發(fā)條件溫和的體系是推廣酶催化的藥物合成反應(yīng)在規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用中重要的途徑。

生物催化劑最主要的就是需要有高活性, 而要在生產(chǎn)實(shí)踐中運(yùn)用則需要低成本[15]。自然界生物中存在豐富的酶資源，但能用于作為工業(yè)生產(chǎn)生物催化劑的不多，主要是因?yàn)槊傅幕钚员灰恍┕I(yè)的極端環(huán)境所限制(高溫、高壓、pH值等)，這種條件下容易失去活性。研究者為了克服這些難題，通常選擇在極端環(huán)境中生存的微生物體內(nèi)挖掘耐受極端環(huán)境的酶，比如rTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用[4]。但此種方法局限性大，而且不易培養(yǎng)。當(dāng)然基因技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上促進(jìn)了新酶發(fā)掘[5]。但獲得耐受性高的酶大部分具有更強(qiáng)的目標(biāo)性和不確定性，在實(shí)際生產(chǎn)中并未大規(guī)模應(yīng)用。因此，酶催化的合成，目前最直接的途徑是從生物體內(nèi)合成提取，這樣在獲得藥物時(shí)避免了特殊反應(yīng)條件的配備。于是也有部分合成工藝在生物體內(nèi)進(jìn)行。這些途徑都極度依賴目標(biāo)生物體。為了實(shí)現(xiàn)脫離生物體的酶催化反應(yīng)的條件，除了在酶的本身進(jìn)行改造之外，人們不斷地模擬各種相應(yīng)生物體環(huán)境。這些反應(yīng)環(huán)境主要包括以下幾類：①水相反應(yīng)體系，②有機(jī)相反應(yīng)體系，③氣相反應(yīng)體系，④超臨界流體，⑤離子液體，⑥雙水相反應(yīng)體系。

雙水相體系是一類新型的且具有極大開發(fā)價(jià)值的酶催化反應(yīng)介質(zhì)。雙水相體系一般由兩種不同的聚合物，一種聚合物與一種親液鹽，或一種離散鹽和一種親液鹽，并在適當(dāng)?shù)耐獠凯h(huán)境誘導(dǎo)下(溶質(zhì)濃度、環(huán)境溫度、光照條件、pH值等)形成[6]。雙水相體系在反應(yīng)中的優(yōu)點(diǎn)主要是消除產(chǎn)物抑制和催化劑的分離。前者可以促進(jìn)催化過(guò)程，提高反應(yīng)速率；后者簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的分離過(guò)程，有效地控制了成本[7]。非離子類型的雙水相體系，具有離子強(qiáng)度低的特點(diǎn)。所用原料都是非揮發(fā)性成分，可循環(huán)利用，對(duì)操作環(huán)境造成較小影響，也被廣泛認(rèn)為是典型的綠色工藝。所以該體系與傳統(tǒng)反應(yīng)分離流程中的操作相比具有顯著優(yōu)勢(shì)，是一種有效的包括藥物合成在內(nèi)的生物催化體系[8]?；陔p水相體系和酶催化的優(yōu)點(diǎn)，以及當(dāng)前人們對(duì)新型藥物的需求，本文將選用幾種較為常見(jiàn)的例子進(jìn)行論述。一方面，對(duì)藥物的類型上進(jìn)行分類，以獲得相關(guān)的規(guī)律性，便于指導(dǎo)后續(xù)的相關(guān)研究工作；另一方面，對(duì)相關(guān)合成例子的擴(kuò)展，使相關(guān)知識(shí)對(duì)運(yùn)用于其它領(lǐng)域起到啟示性作用。因此，通過(guò)本文的研究，使雙水相體系中的酶催化藥物合成技術(shù)期待在更多的領(lǐng)域得到關(guān)注和應(yīng)用，促進(jìn)該新型技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

2 不同種類藥物的雙水相合成

2.1 抗生素類藥物的合成

2.1.1 氨芐西林

氨芐西林是廣泛應(yīng)用于臨床治療的一種抗生素，具有良好的抗菌能力和較小的毒副作用[9]。在合成氨芐西林的化學(xué)過(guò)程中，需要基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)等苛刻條件以及產(chǎn)生毒性較大的氯等有機(jī)化合物，產(chǎn)生的廢物難以回收利用，殘留在環(huán)境中會(huì)污染環(huán)境。為了克服上述缺點(diǎn)，青霉素?；复呋铣砂逼S西林反應(yīng)條件溫和，有機(jī)溶劑用量少，反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，是環(huán)境友好型工藝[10]。但是需要投入大量原料，往往造成大量原料浪費(fèi)，生產(chǎn)成本高導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)不高，限制了大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。Andersson等利用酶催化反應(yīng)在以8.9%的聚乙二醇-2000/7.6%的磷酸鉀溶液為基礎(chǔ)的雙水相系統(tǒng)進(jìn)行氨芐西林的合成，并取得95%以上的酶回收效果[11]。邵晨等根據(jù)氨芐西林和生產(chǎn)原料的溶解性特點(diǎn)，采用親水性離子[Bmim]BF4和鹽溶液作為反應(yīng)體系的雙水相[12]。實(shí)驗(yàn)表明，該方法可以將氨芐西林的回收率提到70.79%，反應(yīng)效率也同時(shí)得到很大提升。宋肖單等在聚乙二醇(PEG-4000，w=20%)和(NH4)2SO4,w=15%)組成的雙水相體系中合成氨芐西林[10]。在該雙水相體系中反應(yīng)的產(chǎn)率達(dá)到了80%，與原水溶劑中其產(chǎn)率為27%相比具有明顯的提高。而且在連續(xù)4次的合成之后，最高達(dá)到98%的產(chǎn)率。反應(yīng)效率提高，源于產(chǎn)物溶解于上層溶液中，消除了抑制作用，化學(xué)平衡往正方向移動(dòng)。此外，由于產(chǎn)物往上層聚集，也簡(jiǎn)化了產(chǎn)物氨芐西林的分離和純化的過(guò)程。因此，采用雙水相體系催化合成氨芐西林，極大的節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.1.2 6-氨基青霉烷酸

目前，6-氨基青霉烷酸(6-APA)的重要合成前驅(qū)體是青霉素G。青霉素G本身對(duì)敏感病原體有強(qiáng)大的滅殺作用且毒性低微而被廣泛使用，臨床上常為抗菌藥物的首選[13]。這種中間體抑菌能力小且可以通過(guò)引入不同側(cè)鏈來(lái)獲得許多藥效不同的青霉素。但使用青霉素?；甘骨嗝顾谿 裂解時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種應(yīng)用存在產(chǎn)物抑制，并且青霉素?；覆环€(wěn)定，產(chǎn)率低下。因此，一種具有光敏性質(zhì)且可循環(huán)利用的聚合物被合成[14]。Dextran與該高聚物形成雙水相體系，該雙水相體系可用于催化青霉素G使其裂解為6-APA，可解除產(chǎn)物或者底物的抑制，使產(chǎn)率大大提高。

2.1.3 頭孢霉菌類抗生素

頭孢氨芐是一種半合成的第一代口服頭孢霉菌類抗生素藥物。該類藥物的作用機(jī)制是通過(guò)抑制菌類細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物膨脹至破裂，實(shí)現(xiàn)殺死細(xì)菌。朱建航等構(gòu)建了20%聚乙二醇400/15%硫酸鎂組成的雙水相體系，并證明該體系在酶催化合成頭孢氨芐顯示了高效的性能。頭孢氨芐在聚乙二醇上相進(jìn)行富集、青霉素酰化酶在硫酸鎂下相分配[15]。通過(guò)兩相之間組分的萃取，消除產(chǎn)物抑制并打破化學(xué)反應(yīng)的平衡，使反應(yīng)平衡向有利的合成反應(yīng)方向進(jìn)行，最終的結(jié)果可將產(chǎn)率從單一水相的20%提高到60%左右。

頭孢丙烯也屬于一種口服頭孢霉菌類抗生素藥物，可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，主要用于治療復(fù)發(fā)性、急性中耳等呼吸道感染。頭孢丙烯的安全性和臨床型治療使其成為一種具有競(jìng)爭(zhēng)力的治療抗生素，但其傳統(tǒng)的合成方法及化學(xué)技術(shù)成本極高[16]。Pan等采用以7-氨基-3-(1-丙烯基)-4-頭孢菌酸母核和(R)-氨基-(4-羥基苯基)乙酸甲酯鹽酸鹽為?；w，在以丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲胺乙酯和甲基丙烯酸丁酯為原料合成的PADB和PMDB組成的雙水相體系，用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯[17]。因其組成雙水相體系的兩種共聚物有易于放大、回收率高等特點(diǎn)，可用于進(jìn)一步地工業(yè)化生物分離。

2.1.4 6-甲基氫化可的松

甾體藥物已經(jīng)成為僅次于抗生素的第二大類藥物。在甾體藥物或其中間體的合成路線中,微生物轉(zhuǎn)化是不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)甾類藥物 A 環(huán)Δ1 脫氫可以提高藥理活性和降低副作用[20]。但是在該脫氫過(guò)程面臨著甾類底物在水溶液培養(yǎng)基中的溶解度差的問(wèn)題，降低了轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)大量的反應(yīng)底底物集中在一相時(shí)，也存在不同程度的產(chǎn)物(底物)抑制[21]。孫新宇等在對(duì)PEG/Dextran雙水相體系進(jìn)行選擇和優(yōu)化后甾類化合物6-甲基氫化可的松的生物轉(zhuǎn)化[22]。利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌內(nèi)Δ1脫氫酶在配比為16% PEG 20000/4% Dextran 40000的雙水相體系中將6-甲基氫化可的松脫氫轉(zhuǎn)化為6-甲基潑尼松龍。雙水相體系脫氫轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)技術(shù)提高了25%～30%，并且增大了底物的投料濃度。

2.2 神經(jīng)類藥物(普瑞巴林)

普瑞巴林((S)-(+)-3-氨基甲基-5-甲基己酸)是一種親脂性物質(zhì)4-氨基丁酸(GABA)類似物，作為L(zhǎng)yricaTM上市用于治療癲癇[18]。雖然普瑞巴林最初是用于部分癲癇的輔助治療，但最近的研究表明，它對(duì)神經(jīng)性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛和焦慮障礙的治療有效[19]。(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)是普瑞巴林的關(guān)鍵手性中間體。Wu[14]等在研究了幾種由無(wú)機(jī)鹽和親水溶劑組成的雙水相體系從生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中提取(S)-CMHA的可行性后。經(jīng)過(guò)5種親水溶劑和鹽類測(cè)試中，結(jié)果表明：硫酸銨和丙酮是提取(S)-CMHA的最佳雙水相體系。在對(duì)比幾次試驗(yàn)后結(jié)果表明(S)-CMHA在中性和堿性條件下更穩(wěn)定，且其(S)-CMHA的回收率高達(dá)99.15%。這些結(jié)果表明：兩步法是大規(guī)模提取(S)-CMHA的一種有前途的策略。因此雙水相體系酶催化為其提供了良好的酶促反應(yīng)分離能力，并且增大了酶與產(chǎn)物的回收效率。

2.3 氨基酸類化合物

2.3.1 2-甲基-L-色氨酸

2-甲基-L-色氨酸是抗菌素硫鏈絲菌肽合成中重要的中間體，含有2-甲基色氨酸的寡肽化合物可以使親軀體細(xì)胞釋放生長(zhǎng)素，使動(dòng)物的生長(zhǎng)速度加快[23]。徐禮生等在水/有機(jī)溶劑雙相中，以L-絲氨酸和2-甲基吲哚為底物，利用重組大腸桿菌DM206種子液[pETDuettrpBA+trpA/BL21(DE3)]色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸，并優(yōu)化了其轉(zhuǎn)化條件[24]。通過(guò)增加體系中有機(jī)相濃度提高了酶反應(yīng)速率，大大縮減了整體的反應(yīng)時(shí)間，顯示出了綠色高效的合成方法。

2.3.2 L-苯丙氨酸

L-苯丙氨酸作為人體所需的八大氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[25]。苯丙氨酸可以作為飲料添加劑，添加到食品中，還可作為一些藥物的中間體。徐虹等用兩菌雙酶法由苯丙酮酸生產(chǎn)L-苯丙氨酸[26]。孫廣海在經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后最終選定20%PEG 1000/16%磷酸鈉鹽為雙水相酶法轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸最佳的雙水相體系[27]。在轉(zhuǎn)氨酶的作用下大腸桿菌細(xì)胞與底物大都被分配到了上相，而產(chǎn)物 L-苯丙氨酸相當(dāng)大一部分被分配到了下相。由于雙水相體系對(duì)細(xì)胞酶活力起穩(wěn)定作用，在多批次轉(zhuǎn)化中，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率相比于傳統(tǒng)水相體系的轉(zhuǎn)化率提高了27.4%。

2.4 復(fù)合凝膠微球的制備

在藥物發(fā)揮作用的過(guò)程中，除了目標(biāo)分子的直接效用，輔助成分也起著重要的作用。凝膠微球在控制藥物釋放速率、包裹與封存固定化酶領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，其中在傳遞系統(tǒng)中的涉及的蛋白類分子尤為突出，因此研究也更為廣泛[28，29]。海藻酸鈣凝膠因其具有良好的生物相容性、降解性、粘附性，無(wú)毒害等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于此類研究[30]然面，單組分的海藻酸鈣面臨著包埋率低的問(wèn)題，使它的應(yīng)用在一定程度上被限制。孟世昕利用微滴柱法在雙水相系統(tǒng)與海藻酸鈣凝膠材料結(jié)合生成一種新型復(fù)合凝膠微球，除了提高單分子蛋白的包埋率，還將實(shí)現(xiàn)有效組分的可控釋放[29]。與傳統(tǒng)工藝相比，復(fù)合凝膠微球?qū)SA擁有超過(guò)90%的包埋率，并驗(yàn)證了其擁有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)及強(qiáng)度，且將會(huì)適用于多種環(huán)境的應(yīng)用中。

3 結(jié)論與展望

本文研究了雙水相體系中酶催化反應(yīng)在藥物合成方面的幾個(gè)應(yīng)用，突現(xiàn)了雙水相體系中酶催化的優(yōu)勢(shì)?？紤]到化學(xué)反應(yīng)與酶催化工程發(fā)展的要求相結(jié)合，雙水相體系具有廉價(jià)易得，條件溫和便于循環(huán)利用，以及在催化反應(yīng)中可以消除底物/產(chǎn)物抑制等特點(diǎn)而被廣泛研究。但由于雙水相也有一些的自身特點(diǎn)限制了其自身的發(fā)展。如果想要提取產(chǎn)物，需要使得兩相混合分離，分離步驟將需要反應(yīng)分離過(guò)程耗時(shí)耗能。此外，不同的生物活性物質(zhì)在不同的雙水相體系中也具有不同的分配比例，沒(méi)有一種普適性的雙水相體系適合所有的酶催化反應(yīng)，導(dǎo)致需要不斷地探索發(fā)現(xiàn)雙水相與酶催化反應(yīng)的契合度。影響溶質(zhì)在雙水相體系中分配比的因素有很多，比如形成雙水相的種類及濃度、溶質(zhì)本身的電荷、分子量、濃度等特性，而萃取的耦合的關(guān)鍵在于需要底物，酶催化劑和產(chǎn)物的分配傾向于不同的相中，這大大增加了選擇合適雙水相體系用于酶催化反應(yīng)的難度。雙水相體系中酶催化反應(yīng)相對(duì)于傳統(tǒng)工藝有非常大的優(yōu)勢(shì)，值得利用其進(jìn)行更好地發(fā)展。雙水相體系進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)時(shí)間較短，經(jīng)濟(jì)，綠色，表明雙水相體系有較好的應(yīng)用前景。