芪地固腎片對膜性腎病大鼠的腎保護作用

馮 喆， 雷根平， 王 婷， 黃亞蘭， 董 盛

(1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；3.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣州 深圳 518101)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是晚期腎病(end-stage kidney disease，ESKD)的主要可鑒定原因之一[1]。該病是以腎病綜合征為主要臨床表現(xiàn)，以腎小球足細胞下免疫復合物的沉積伴足突融合、基底膜彌漫性增厚為病理特征的一組疾病[2]。其特點是自身抗體與靶抗原共定位形成免疫復合物，在腎小球基底膜的上皮下側積聚，從而導致補體激活、釋放炎癥因子，出現(xiàn)足細胞的損傷和蛋白尿的發(fā)展。目前國內(nèi)外流行病學研究顯示膜性腎病的發(fā)病率逐年上升。一項國內(nèi)多中心研究表明該病在近11年間以每年13%的速度增長[3]。然而，數(shù)十年來關于膜性腎病的治療一直是激烈的辯論問題。西醫(yī)公認的治療方案為糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細胞毒藥物，但是存在治療效果不佳或者應用禁忌等問題，因此尋求更為合適的治療藥物對于改進治療策略至關重要。近些年，中醫(yī)藥治療膜性腎病顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，在改善臨床癥狀、減輕不良反應、預防復發(fā)等方面都具有更好的有效性及安全性[4]。芪地固腎片為陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院治療膜性腎病的特色院內(nèi)制劑，具有健脾補腎、益氣養(yǎng)陰、清利活血的功效，且已臨床應用多年，治療穩(wěn)定，功效確切[5-6]。為進一步揭示其作用機制，本研究通過構建陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)腎炎模型，觀察芪地固腎片不同劑量對大鼠腎功能、肝功能、血脂、24 h尿蛋白定量(UTP)、炎癥因子白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響，進而從足細胞微結構蛋白變化方面探討該方對膜性腎病足細胞的保護作用，以期為開發(fā)治療膜性腎病的藥物提供實驗基礎。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。

1.2 藥物 芪地固腎片組方藥材生黃芪、生地黃、丹參、白花蛇舌草、芡實、荊芥，由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心提供，按照成人與大鼠體表面積系數(shù)換算后，高劑量組為每天0.55 g/kg，低劑量組為每天0.138 g/kg，用19 mL 56 ℃雙純水溶解5.25 g藥物，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司)；NLRP3炎癥小體抑制劑Bay11-7082(上海陶素生化科技有限公司)。

1.3 試劑與儀器 牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)；PBS緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；nephrin抗體、podocin抗體、CD2AP抗體(英國Abcam公司)；F-actin兔多克隆抗體、synoptopodin兔多克隆抗體、α-actinin-4兔多克隆抗體、Animal Total RNA Isilation Kit、RT EasyTMII(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)、Real Time PCR EasyTM(成都福際生物技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；預染蛋白Marker(美國NEB公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)。光學顯微鏡[蔡司光學儀器(上海)國際貿(mào)易有限公司]；H-600型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；TB-718EL型病理切片機(湖北泰維科技實業(yè)股份有限公司)；LX20型全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；NanoDrop 2000紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；蛋白質(zhì)電泳及轉膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；5417 R型高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，檢測24 h UTP<5 mg后開始造模，隨機分為空白組10只、造模組50只。造模組參照文獻[7]報道的方法構建陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)膜性腎病模型，預免疫1周后正式免疫，尾靜脈注射C-BSA(注射前用PBS緩沖液配成溶液)16 mg/kg，空白組注射等量生理鹽水，隔日1次，共4周，以24 h UTP>10 mg為造模成功。造模大鼠隨機分為5組，即模型組、模型抑制組、鹽酸貝那普利組及中藥(芪地固腎片)高、低劑量組，每組10只，模型抑制組腹腔注射15 μmol/kgBay11-7082，空白組、模型組灌胃給予雙純水3 mL，鹽酸貝那普利組給予鹽酸貝那普利片3.6 mg/kg，中藥高、低劑量組給藥劑量分別為550、138 mg/kg，各給藥組每天給藥1次，連續(xù)4周。

2.2 指標檢測

2.2.1 24 h UTP 造模前、造模結束后、給藥2周和4周后，收集大鼠24 h尿液，記錄尿量，采用硫磺酸-硫酸鈉法計算24 h UTP。

2.2.2 血液生化指標 給藥4周后，10%水合氯醛以300 mg/kg劑量麻醉大鼠，剖開腹腔，腹主動脈采血，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上層血清，送至陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平。

2.2.3 病理形態(tài)學 大鼠采血后摘取腎臟，PBS緩沖液沖洗，剝離被膜，部分腎皮質(zhì)置于4%戊二醛中固定，進行電鏡檢查；剩余組織置于10%多聚甲醛中固定，進行光鏡檢查。光鏡檢測方法為腎臟組織經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片后脫蠟至水，蘇木素染色后水洗，乙醇分化，再次沖洗后返藍，梯度乙醇脫水，伊紅染色后水洗，透明，封片，最后鏡檢，拍照記錄；電鏡檢測方法為取部分腎上極，4%戊二醛、1%鋨酸磷酸鈉緩沖液固定，PBS緩沖液沖洗，乙醇及丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察腎小球基底膜、足突改變情況，采集圖像。

2.2.4 腎組織IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表達 將大鼠新鮮腎組織研磨均勻后，采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度儀檢測其濃度和純度，以β-actin為參照反，轉錄試劑盒進行實時熒光定量PCR，將總RNA反轉錄為cDNA，各組基因同時擴增，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，45循環(huán)。采用2-ΔΔCT法處理數(shù)據(jù)。

2.2.5 腎組織nephrin、podocin蛋白表達 提取大鼠腎臟總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后上樣、電泳、轉膜、封閉，加入內(nèi)參β-actin一抗(1∶5 000)、nephrin一抗(1∶3 000)、podocin一抗(1∶2 000)，在4 ℃下孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫下孵育2～3 h，顯影，定影，進行圖像分析。

2.2.6 腎組織F-actin、synoptopodin和α-actinin-4蛋白表達 大鼠腎臟組織脫水后包埋、切片，放入染色缸，3%甲醇雙氧水室溫10 min后PBS緩沖液洗滌3次，將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，高火加熱，冷卻后PBS緩沖液洗滌2次，滴加山羊血清封閉液，一抗4 ℃過夜，二抗30 min后PBS緩沖液洗3次，DAB顯色試劑混勻后滴加到切片上，洗滌，蘇木素復染、脫水、透明、樹膠封片，最后鏡檢。

3 結果

3.1 一般狀態(tài) 空白組大鼠精神良好、反應靈敏、毛發(fā)有光澤、飲食正常；模型組大鼠精神萎靡不振、反應遲鈍、毛發(fā)欠光澤、攝食減少；各給藥組大鼠上述情況均有所好轉；各組大鼠尾巴均有不同程度瘀瘢。實驗過程中，共有5只大鼠死亡，造模期間，1只由于注射藥物濃度過高致死，2只由于固定過度壓迫致死；給藥期間，1只給藥后由于灌胃失誤致死；1只死亡不明。

3.2 24 h UTP比較 造模結束后，與空白組比較，模型組、各給藥組大鼠24 h UTP升高(P<0.01)。給藥2周后，與模型組比較，各給藥組大鼠24 h UTP無明顯變化(P>0.05)。給藥4周后，與模型組比較，中藥高劑量組、鹽酸貝那普利組大鼠24 h UTP降低(P<0.01)，模型抑制組高于中藥高劑量組(P<0.05)，中藥低劑量組無明顯變化(P>0.05)；與鹽酸貝那普利組比較，中藥高劑量組、模型抑制組大鼠24 h UTP無明顯變化(P>0.05)，中藥低劑量組升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠24 h UTP比較

3.3 血液生化指標 與空白組比較，模型組、中藥低劑量組大鼠TP水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠TP水平升高，以模型抑制組、中藥高劑量組、鹽酸貝那普利組更明顯(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，模型組、中藥低劑量組大鼠ALB水平降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥高劑量組、鹽酸貝那普利組大鼠ALB水平升高(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，模型組、模型抑制組、中藥低劑量組大鼠TC、TG水平升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，中藥高劑量組、模型抑制組、鹽酸貝那普利組大鼠TC、TG水平降低(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠BUN水平升高(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、中藥高劑量組大鼠BUN水平降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組、中藥低劑量組大鼠Scr水平升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥高劑量組、模型抑制組、鹽酸貝那普利組大鼠Scr水平降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血液生化指標比較

3.4 腎組織病理變化 圖1顯示，空白組大鼠腎臟組織完整、結構正常、無明顯病變；模型組大鼠腎小球結構出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、腎小球體積增大、少量的炎細胞浸潤；模型抑制組、中藥低劑量組、模型組大鼠病變較重，而中藥高劑量組、鹽酸貝那普利組相對較輕。圖2顯示，空白組大鼠腎小球毛細血管壁內(nèi)皮細胞結構正常，內(nèi)皮窗孔排列均勻，基底膜完整，上皮細胞(足細胞)足突呈杵狀、排列規(guī)整；模型組大鼠基底膜彌漫性增厚，上皮下電子致密物沉積，上皮細胞足突彌漫融合；鹽酸貝那普利組大鼠基底膜增厚略輕于模型組；中藥高劑量組大鼠基底膜輕度增厚，上皮下少數(shù)電子致密物沉積，上皮細胞足突部分融合；中藥低劑量組、模型抑制組大鼠情況與模型組無明顯差異。

圖1 各組大鼠腎組織光鏡圖(HE，×400)

圖2 各組大鼠腎組織電鏡圖(×10 000)

3.5 腎組織IL-1β、IL-18和TNF-αmRNA表達 與空白組比較，模型組大鼠腎組織IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，模型抑制組、中藥高劑量組、鹽酸貝那普利組大鼠腎組織IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)；與鹽酸貝那普利組比較，模型抑制組、中藥高劑量組大鼠腎組織IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表達無明顯變化(P>0.05)，中藥低劑量組IL-1β、IL-18 mRNA表達升高(P<0.05)，TNF-αmRNA表達無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腎組織IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA表達比較

3.6 腎組織nephrin、podocin、CD2AP蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠腎組織nephrin、podocin、CD2AP蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、中藥高劑量組、模型抑制組大鼠腎組織nephrin、podocin、CD2AP蛋白表達升高(P<0.01)，見表4、圖3。

表4 各組大鼠腎組織nephrin、podocin、CD2AP蛋白表達比較

圖3 各組大鼠腎組織nephrin、podocin、CD2AP蛋白表達

3.7 腎組織F-actin、synoptopodin、α-actinin-4骨架蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠腎組織F-actin、synoptopodin蛋白表達降低(P<0.01)，α-actinin-4蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、中藥高劑量組大鼠腎組織F-actin、synoptopodin蛋白表達升高(P<0.01)，見表5、圖4。

注：陰性細胞呈藍色，底物為白色；陽性細胞呈黃色或棕黃色。

表5 各組大鼠腎組織F-actin、synoptopodin、α-actinin-4蛋白表達比較

4 討論

膜性腎病作為一種自身免疫炎性疾病，抗原物質(zhì)在腎小球足細胞膜上表達，與自身抗體相結合，形成上皮下的免疫復合物，刺激基底膜的增厚和足細胞結構蛋白的改變。足細胞結構蛋白中作為中心環(huán)節(jié)的細胞骨架蛋白，直接或間接地與裂孔隔膜蛋白、基底膜蛋白、頂膜蛋白連接，調(diào)節(jié)足細胞的形狀、結構、穩(wěn)定性以及裂孔隔膜的插入、黏附，并對環(huán)境刺激作出動態(tài)響應。F-肌動蛋白(F-actin)、突觸孔蛋白(synoptopodin)和α-輔肌動蛋白4(α-actinin-4)等構成足細胞的基本細胞骨架，維持著足細胞的形態(tài)，對腎小球的有效濾過及維持腎功的正常至關重要。當足細胞骨架的穩(wěn)定性被破壞時，會造成足細胞結構損傷，進而導致濾過功能障礙，形成蛋白尿[8]。

此外，擔任足細胞彼此間連接橋梁的裂孔隔膜橫跨于鄰近的足突之間，其不僅可充當復雜的信號樞紐，將不同的化學和機械信號傳到足細胞[9]，還可以防止血漿蛋白滲入到原尿中[10]。近年來在裂孔隔膜上發(fā)現(xiàn)了多個在足細胞表達的裂孔隔膜蛋白，如nephrin、podocin等。當足細胞骨架的失調(diào)亦或裂孔隔膜結構完整性的喪失均可導致足細胞受損，而足細胞損傷又是包括膜性腎病在內(nèi)的腎小球疾病發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素[11]。因此，保護足細胞可能對找尋膜性腎病有效的治療靶點意義非凡。

已有的研究表明特發(fā)性膜性腎病患者存在明顯的腎臟組織炎性損傷和足細胞損傷[12]，一些炎癥因子在發(fā)生過程中起著關鍵作用。如TNF-α作為一種多效性細胞因子，在炎癥反應中有廣泛的調(diào)節(jié)聯(lián)動功能，可導致多種其他促炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[13]，加重腎臟炎性損傷。因此，調(diào)控炎癥因子進而降低足細胞損傷是防治膜性腎病的關鍵。

雷根平教授基于長期的臨床實踐，以沈金鰲《雜病源流犀燭》所載古方參芪地黃湯為基礎方，略作調(diào)整創(chuàng)立了芪地固腎方及其復方制劑芪地固腎片。該方藥物組成有黃芪、生地、芡實、白花蛇舌草、荊芥、丹參；方中黃芪有利尿消腫之效，其升舉之力可使下泄之精微回歸[14]，此外黃芪還能補氣托毒，排膿生肌，有利于腎小球結構與功能的恢復[15]；生地滋陰補腎，與黃芪共為君藥以治本；臣以芡實益腎固精，可助黃芪益氣培元；白花蛇舌草清熱降濁解毒，與黃芪配伍一升清、一降濁；丹參通利血脈，活血化淤，與黃芪相配，體現(xiàn)“氣行則血行”，白花蛇舌草與丹參共為佐藥；使以荊芥宣發(fā)肺氣，宣上暢下以利水之下行。諸藥相伍，配伍合理，組方嚴謹，集健脾補腎、益氣養(yǎng)陰、清利活血于一身，標本兼顧[16]。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可抑制炎癥因子表達，調(diào)節(jié)免疫功能。該作用與其可以阻斷NF-κB信號通路的激活，從而降低TNF-α[17]、IL-1β、趨化因子等基因的表達有關；并且可以調(diào)節(jié)脂代謝、抗細胞凋亡、保護足細胞表型和結構。此外，黃芪甲苷可降低細胞骨架蛋白受損以減輕足細胞的損傷，進而防治膜性腎病[18]。生地具有類似糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用[19]，且有研究表明[20]生地有效成分環(huán)烯醚萜苷可下調(diào)desmin蛋白表達，上調(diào)nephrin蛋白表達，以此改善足細胞損傷。芡實能清除自由基，有較強的抗氧化功能，以此治療腎病蛋白尿，改善腎臟微循環(huán)[21]。白花蛇舌草可抑制脂多糖誘導的腎臟炎癥反應，下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達[22]。丹參具有改善血流動力學，糾正血液高凝狀態(tài)，促進腎臟血管擴張的作用，其有效成分丹參多酚酸鹽能夠恢復足細胞相關蛋白進而維持足細胞結構和功能的完整性[23]。荊芥的乙醇提取物能抑制脂多糖誘導的細胞表面分子CD80和CD86的表達和促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-16的產(chǎn)生[24]。另外，荊芥揮發(fā)油的抗炎作用還與抑制NLRP3炎癥小體的激活相關[25]。以上研究為本方保護腎組織微結構蛋白、進而保護足細胞、減少蛋白尿提供了藥理學依據(jù)。

本研究從足細胞微結構蛋白及炎癥因子角度對芪地固腎片治療膜性腎病的作用機制進行了探索性的研究。經(jīng)實驗觀察，給藥后可降低膜性腎病大鼠24 h UTP、升高ALB，降低血脂，改善腎功能，說明芪地固腎片對膜性腎病大鼠具有明確的治療作用。進一步研究提示，模型組大鼠腎組織nephrin、podocin、CD2AP、F-actin及synoptopodin蛋白表達降低，炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α mRNA的表達升高；而芪地固腎片、鹽酸貝那普利及Bay11-7082均可上調(diào)nephrin、podocin和CD2AP蛋白的表達，降低IL-1β、IL-18和TNF-αmRNA的表達，同時芪地固腎片亦可上調(diào)F-actin及synoptopodin蛋白的表達，在一定程度上保護足細胞，以高劑量作用顯著。此外，該方還可以有效的抑制膜性腎病大鼠腎小球基底膜免疫復合物的沉積以及基底膜的增厚，延緩腎臟病理的進展。綜上，芪地固腎片對膜性腎病大鼠的腎保護作用，其機制可能是通過影響NLRP3炎癥小體合成，下調(diào)IL-1β、IL-18炎癥因子的釋放，降低足細胞損傷，從而減少蛋白尿。