基于酶標(biāo)儀測(cè)定的斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂條件優(yōu)化研究

李 艾，郝玉翠

(唐山學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河北 唐山 063000)

微生物油脂是指產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營(yíng)養(yǎng)成分缺乏的條件下，將過(guò)量碳源轉(zhuǎn)化合成為甘油三酯，并儲(chǔ)存于微生物細(xì)胞內(nèi)的一種單細(xì)胞油脂[1]。微生物油脂主要由十六碳和十八碳的飽和及不飽和的長(zhǎng)鏈脂肪酸組成，其脂肪酸組成與棕櫚油、菜籽油、大豆油等植物油相似，是生物柴油的潛在理想替代原料[2-3]。產(chǎn)油微生物中尤以酵母和霉菌類(lèi)積累的油脂與常規(guī)植物油有更相似的脂肪酸[4]。

蘇丹黑B是一種脂溶性的偶氮染料，當(dāng)產(chǎn)油微生物菌株加入染液后，蘇丹黑B便離開(kāi)染液而溶于微生物細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)中，此時(shí)產(chǎn)油微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂著色而呈現(xiàn)出一種藍(lán)黑色。所形成的藍(lán)黑色物在特定波長(zhǎng)下吸收峰值的大小與微生物細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著相關(guān)，利用該關(guān)系可檢測(cè)產(chǎn)油微生物細(xì)胞內(nèi)油脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[5]。

顯色物質(zhì)的傳統(tǒng)測(cè)定方法為紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法，但該方法操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)樣品均一性、穩(wěn)定性要求嚴(yán)格；而且經(jīng)過(guò)染色處理后的產(chǎn)油微生物其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，穩(wěn)定性下降，細(xì)胞更易下沉，均一性很差，因此，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)定時(shí)效性短，產(chǎn)生的誤差較大。而全自動(dòng)酶標(biāo)儀使用垂直光路檢測(cè)，受細(xì)胞下沉聚集影響較小，對(duì)樣品的均一性要求較低。

產(chǎn)油微生物產(chǎn)油率的高低與碳源、氮源、溫度、培養(yǎng)基碳氮比、接種量等因素有直接關(guān)系。趙人俊等[6]在研究被孢霉M14菌株產(chǎn)油脂的條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源有利于細(xì)胞增殖，而無(wú)機(jī)氮源有利于油脂的積累。一些產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營(yíng)養(yǎng)成分缺乏情況下，特別是在氮源限制下油脂會(huì)過(guò)量積累，因此，碳氮比是決定油脂含量和生物量的一個(gè)關(guān)鍵因素。有研究表明，提高培養(yǎng)基的碳氮比，有利于細(xì)胞內(nèi)油脂含量的增加[7-8]。在限氮條件下，生物量及油脂含量均隨著碳氮比的提高而增大，但油脂含量達(dá)到最大值時(shí)，隨著碳氮比的繼續(xù)提高，油脂含量卻會(huì)有所下降[9]。接種量的大小影響菌株在發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)繁殖的速度，接種量較大可縮短菌株繁殖期，使其快速到達(dá)穩(wěn)定期，盡快合成產(chǎn)物，并減少雜菌的污染。但接種量過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；過(guò)小會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵的生產(chǎn)率。

本文以斯氏油脂酵母為研究菌株，基于被蘇丹黑B染色后其吸光度值與油脂含量的正比關(guān)系，利用此吸光度值快速反映油脂含量的方法，優(yōu)化斯氏油脂酵母發(fā)酵過(guò)程中的氮源、碳氮比(C/N)和接種量三個(gè)發(fā)酵條件，探討三個(gè)因素在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)斯氏油脂酵母生長(zhǎng)及油脂積累的影響，以便更好地提高此微生物的油脂產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 菌株

斯氏油脂酵母(Lipomyces Starkeyi，CICC 1809)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器設(shè)備

3H16RI高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)；M2全自動(dòng)酶標(biāo)儀；DMI8 Leica倒置熒光顯微鏡；SGD-IV全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀。

1.3 培養(yǎng)條件

YEPD固體斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO37 g/L，MgSO41.5 g/L。

限氮發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO31 g/L。在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)氮源、碳氮比和接種量三個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化，以得到斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的最佳條件。

將保藏的菌株接種至YEPD固體斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～4 d。取適量活化后的菌體接種于種子培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～4 d。然后取一定量的種子液按一定的接種量接種于限氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 蘇丹黑B染液的配制

在100 mL 70%乙醇中加入準(zhǔn)確量取的蘇丹黑B 0.6 g，室溫下放置6～7 d，待其充分溶解后過(guò)濾，將濾液放入棕色密閉瓶于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.4.2 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后吸收光譜的測(cè)定

取2支試管，加入5 mL發(fā)酵液。一支作為實(shí)驗(yàn)管加入蘇丹黑B染液0.3 mL，另一支作為對(duì)照管加入無(wú)水乙醇0.3 mL。將兩支試管振蕩混勻，沸水浴加熱6 min，待冷卻離心棄去上清液后分別用50%的乙醇洗滌菌泥，再三次離心后棄去上清液，然后用70%乙醇溶液混勻菌泥，取96孔板，每孔加入200 μL菌液，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定其特征吸收峰。

1.4.3 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后油脂含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

采用酸熱-有機(jī)溶劑法測(cè)定斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂含量[10]。取發(fā)酵9 d后的發(fā)酵液放入離心管，離心得到濕菌泥，稱(chēng)重后按每克濕菌泥加入15 mL鹽酸溶液(4 mol/L)的比例加入鹽酸，混勻，然后沸水浴中加熱10 min，-20 ℃速冷30 min。冷卻后往離心管內(nèi)加入等體積的氯仿和甲醇混合液(氯仿和甲醇體積比為1∶2)，混勻、離心、取氯仿層，重復(fù)上述步驟，合并氯仿層。50 ℃烘至恒重，冷卻后計(jì)算細(xì)胞內(nèi)總油脂量。然后分別取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL的上述發(fā)酵液，稀釋至6 mL。按上述蘇丹黑B染色方法對(duì)各個(gè)梯度的酵母細(xì)胞進(jìn)行染色，繪制吸光度OD最大吸收峰與對(duì)應(yīng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性曲線(xiàn)。按照上述酸熱-有機(jī)溶劑法測(cè)得的酵母總油脂量，換算出各個(gè)梯度下酵母所含油脂量。

1.4.4 發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y(cè)定

利用SGD-IV全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀直接測(cè)量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色前后對(duì)比圖

用顯微鏡觀察斯氏油脂酵母細(xì)胞培養(yǎng)9 d時(shí)的染色結(jié)果，可清楚地觀察到斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈明顯的藍(lán)黑色(圖1)。

圖1 未染色(上)及培養(yǎng)9 d后染色(下)的斯氏油脂酵母細(xì)胞

2.2 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后特征吸收譜圖

繪制斯氏油脂酵母經(jīng)蘇丹黑B染色后的特征吸收譜圖，如圖2所示。由圖2可知，在600 nm處有較為明顯的吸收峰，因此斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂與蘇丹黑B結(jié)合的最大吸收峰為600 nm。

圖2 斯氏油脂酵母經(jīng)蘇丹黑B染色后的吸收譜圖

2.3 斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按上述方法，建立的斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=16.164x-50.572(R2=0.991 6)，如圖3所示。結(jié)果表明，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和OD600值存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)蘇丹黑B染色后的斯氏油脂酵母細(xì)胞的OD600值可直接得出斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(油脂含量)。

圖3 斯氏油脂酵母細(xì)胞內(nèi)油脂含量與吸光度值的線(xiàn)性關(guān)系

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 氮源對(duì)斯氏油脂酵母積累油脂的影響

按照含氮量大致相等的原則(氮元素含量為0.582 g/L)，分別選擇硫酸銨(2.02 g/L)、酵母膏(8.31 g/L)、蛋白胨(4.66 g/L)為氮源，碳氮比為55∶1，按10%接種量，其他成分均相同，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)。在發(fā)酵過(guò)程中，定期取樣，檢測(cè)蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度、發(fā)酵液還原糖含量，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株發(fā)酵積累油脂的情況，分析不同氮源對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4-6。

圖4 硫酸銨為氮源時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

由圖4可知，斯氏油脂酵母以硫酸銨為氮源時(shí)，還原糖含量從第7 d開(kāi)始迅速下降，但菌體幾乎不再生長(zhǎng)，油脂含量在發(fā)酵9 d時(shí)達(dá)到最大值。由圖5、圖6可知，斯氏油脂酵母分別以酵母膏和蛋白胨為氮源時(shí)，還原糖含量降低趨勢(shì)相對(duì)平緩，油脂含量增長(zhǎng)緩慢，同樣在發(fā)酵9 d時(shí)分別達(dá)到最大值。

圖5 酵母膏為氮源時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

圖6 蛋白胨為氮源時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

由圖4-6可知，發(fā)酵9 d，斯氏油脂酵母以硫酸銨為氮源時(shí)，油脂含量和還原糖的利用率最高(此時(shí)OD600為1.226，還原糖含量為1.01%；而以酵母膏和蛋白胨為氮源時(shí)所對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為1.049，1.014；1.97%，2.12%)，適合油脂的積累；而以酵母膏為氮源時(shí)，菌體密度最大(3.716，而以硫酸銨和蛋白胨為氮源時(shí)所對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為3.116，3.708)，適合菌體的生長(zhǎng)，但不利于油脂的積累。因此，斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂選擇硫酸銨作為氮源。

2.4.2 碳氮比對(duì)斯氏油脂酵母積累油脂的影響

將活化的斯氏油脂酵母接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，按10%接種量接種于不同碳氮比(分別為55∶1，66∶1，77∶1)的以硫酸銨(含量分別為0.2%，0.168%，0.144%)為氮源的限氮發(fā)酵培養(yǎng)基中。在發(fā)酵過(guò)程中，每24 h取上述三種發(fā)酵液分別測(cè)定蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發(fā)酵液還原糖含量，以考察不同碳氮比對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7-9。

圖7 C/N為55∶1時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

由圖7-9可知，C/N分別為55∶1，66∶1的發(fā)酵液在發(fā)酵初期菌體密度增加迅速，而對(duì)于C/N為77∶1的發(fā)酵液在發(fā)酵初期菌體密度增加緩慢。低C/N有利于斯氏油脂酵母菌體的生長(zhǎng)；而C/N過(guò)高、氮含量過(guò)少則會(huì)減緩菌體的生長(zhǎng)。由圖7可知，C/N為55∶1時(shí)，還原糖含量從第7 d開(kāi)始下降緩慢，此時(shí)菌體密度達(dá)到最大值，油脂含量則在第9 d時(shí)達(dá)到最大值。由圖8、圖9可知C/N為66∶1和77∶1時(shí)，還原糖含量均從第8 d開(kāi)始下降趨勢(shì)變緩，此時(shí)菌體密度達(dá)到最大，油脂含量則都在第9 d時(shí)達(dá)到最大值。

圖8 C/N為66∶1時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

圖9 C/N為77∶1時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

由圖7-9可知，發(fā)酵9 d，C/N為66∶1時(shí)，油脂含量和還原糖的利用率最高(此時(shí)OD600為1.194，還原糖含量為1.33%；而C/N為55∶1和77∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為1.126，1.171；1.78%，1.42%)，適合油脂的積累；C/N為55∶1時(shí)，菌體密度最大(3.023，而C/N比為66∶1和77∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為3.002，2.867)，適合菌體的生長(zhǎng)，但不利于油脂的積累；C/N為77∶1時(shí)，由于菌體密度過(guò)低，導(dǎo)致油脂含量降低。因此，斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂選擇最適C/N為66∶1。

2.4.3 接種量對(duì)斯氏油脂酵母積累油脂的影響

將活化的斯氏油脂酵母接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，按發(fā)酵液體積的5%，10%，15%接種于碳氮比為66∶1的以硫酸銨為氮源的限氮發(fā)酵培養(yǎng)基中。在發(fā)酵過(guò)程中，每24 h取上述不同接種量的發(fā)酵液分別測(cè)定蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發(fā)酵液還原糖含量，以考察不同接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖10-12。

圖10 接種量為5%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

圖11 接種量為10%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

圖12 接種量為15%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)油脂情況

由圖10-12可知，接種量分別為10%，15%的發(fā)酵液在發(fā)酵初期菌體密度增加迅速，分別在第8 d和第9 d時(shí)達(dá)到最大值；而接種量為5%的發(fā)酵液在發(fā)酵初期菌體密度增加緩慢，在第9 d達(dá)到最大值。

由10-12可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，發(fā)酵液中還原糖含量最高(為2.87%；而接種量為10%和15%時(shí)所對(duì)應(yīng)的指標(biāo)分別為1.53%，1.52%)，菌體密度及油脂含量很低(菌體密度為2.412，OD600為1.194)，說(shuō)明發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞數(shù)目太少時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分不能被其充分利用，因此導(dǎo)致還原糖含量較高，而菌體密度及油脂含量卻都較低。當(dāng)接種量為10%時(shí)，菌體密度(3.140)與油脂含量最大(OD600為1.274)。當(dāng)接種量為15%時(shí)其菌體密度(3.214)與10%接種量相差不多，但油脂含量(OD600為1.189)比10%要低，可能是發(fā)酵液中的溶氧相對(duì)不足影響了油脂的合成。因此，選擇10%作為最適接種量。

3 結(jié)論

通過(guò)建立斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂含量和OD最大吸收峰的變化曲線(xiàn)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株發(fā)酵積累油脂情況。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發(fā)酵液中還原糖含量對(duì)斯氏油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂條件進(jìn)行優(yōu)化，得到其最佳發(fā)酵產(chǎn)油脂的條件：氮源為硫酸銨，碳氮比為66∶1，接種量為10%。

通過(guò)監(jiān)測(cè)斯氏油脂酵母發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期以酵母膏為氮源有利于菌體繁殖，菌體生物量多，因此綜合考慮，如果要提高油脂產(chǎn)量可在發(fā)酵初期添加酵母膏，待菌株數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定時(shí)再添加硫酸銨，以便積累油脂。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然斯氏油脂酵母經(jīng)蘇丹黑B染色后的吸光度值與油脂含量之間線(xiàn)性關(guān)系顯著，但是針對(duì)不同批次的菌株建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)其線(xiàn)性方程會(huì)有一定的差別。因此，在發(fā)酵過(guò)程中如果需要測(cè)定油脂的絕對(duì)含量，需要每批菌體都繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。