針刺對腦出血大鼠腦組織神經(jīng)細胞鐵死亡的影響

李明月，戴曉紅，匡炳霖，于學平，滕偉，于薇薇，馬慧慧，陳秋欣，曹洪濤，溫鑫，鄒偉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

雖然自發(fā)性腦出血病例在腦卒中占比不超過20%，但其仍然與各種類型腦卒中的高病死率和發(fā)病率關系密切[1]。因此早期識別腦出血，積極發(fā)現(xiàn)腦出血后神經(jīng)細胞死亡的病理機制和干預方法對于改善腦出血疾病的現(xiàn)狀至關重要。鐵死亡于2012年首次被提出，是一種鐵依賴性的脂質過氧化的損傷過程，近幾年研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡是腦出血后神經(jīng)細胞死亡的重要方式[2]。腦出血后血腫溶解,血紅蛋白釋放大量游離鐵，進而引起大量活性氧生成，并誘發(fā)脂質過氧化反應，造成質膜破壞，鐵死亡發(fā)生[3]。另外鐵死亡另一重要特征是有典型的線粒體形態(tài)改變，即線粒體體積縮小，雙層膜密度增強，線粒體嵴減少或缺失，線體體外膜增厚，甚至破裂[4]。針刺在改善出血大鼠肢體功能缺損方面效果顯著[5],同時針灸在抑制腦出血后大鼠神經(jīng)細胞死亡方面也起到至關重要的作用[6]。然而針刺能否通過抑制神經(jīng)細胞鐵死亡改善出血后大鼠的神經(jīng)功能是本研究的重點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供健康清潔級SD雄性大鼠96只，體質量為(280±10)g。大鼠在溫度(22±2)℃范圍內，相對恒定濕度(50±5)%條件下自由飲水、進食，適應性喂養(yǎng)1周后方可入組。將所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組、抑制劑組(DFX)。每組大鼠再按1 d、3 d、7 d 3個時間點隨機分成3個亞組，每個亞組8只。造模前12 h禁食，6 h禁水。

1.2 主要儀器與試劑

立體定位儀(成都儀器廠，STW-1)；牙鉆(上海齒科機械廠，307-6)；針灸針(華佗牌，0.35 mm×40 mm)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(WLA048a，萬類生物，中國)；透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650日立，日本)。

1.3 腦出血模型制備

大鼠稱重后，按照60 mg/kg比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。大鼠被成功麻醉后，頭部備皮，在備皮處用碘伏常規(guī)消毒，后以俯臥位固定于立體定位儀上。取兩耳尖連線中點切口，鈍性分離皮下骨膜，充分暴露前囟點及冠狀縫，以立體定位儀定位坐標點，以前囟點為中心，向右側3.5 mm，向后側0.2 mm，用1.0 mm直徑牙鉆鉆孔至硬腦膜表面。同時剪斷距尾端3 cm處的鼠尾，取血50 μL后將微量注射器固定于立體定位儀上，并沿鉆孔處垂直緩慢進針至基底節(jié)處注血，速度為20 μL/min，留針5 min后緩慢出針。斷尾處消毒包扎，局部噴灑慶大霉素并用牙科水泥密封，眼科針縫合。造模后采用Berderson評分法[7]對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分。評分在1～3分大鼠納入本實驗。

1.4 干預方法

模型組采用自體血注入法制備腦出血大鼠模型，造模后不做任何處理。假手術組接受與模型組相同的各項操作，微量注射器于相同位置進針，注入等量生理鹽水，但不注血。針刺組造模后給予針刺治療，選穴部位參照《實驗動物穴位圖譜》，取大鼠百會穴、患側曲鬢穴，由百會向曲鬢穴透刺，以0.35 mm×40 mm針灸針快速刺入，進針深度15 mm，施以快速捻轉平補平瀉手法，捻轉速度為200 r/min，持續(xù)捻轉5 min，后間隔5 min，反復操作共3次。抑制劑組按照100 mg/kg劑量給予肌肉注射去鐵胺每日1次。

1.5 指標檢測

1.5.1 神經(jīng)功能評估

在造模后的1 d、3 d、7 d時間點應用Ludmila Belayev評分法[8-9]進行神經(jīng)功能評估。該評分法由姿勢反射和放置試驗兩部分組成。放置試驗又分為視覺、觸覺、本體感覺試驗。其中每項按照神經(jīng)功能缺損程度評分0～2分，各項分值相加最高12分，此時神經(jīng)功能缺損程度最重。

1.5.2 透射電鏡觀察線粒體形態(tài)

將保存在2.5%戊二醛中的待測樣本取出，經(jīng)0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗后，用1%鋨酸固定液固定3 h。將固定好的樣本依次經(jīng)過50%、70%、90%乙醇、90%乙醇和90%丙酮(1∶1)混合液、90%、100%丙酮脫水15～20 min，重復3次。經(jīng)包埋、固化后的樣本使用超薄切片機進行切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，蒸餾水洗凈晾干后讀片。

1.5.3 神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)表達

將保存在固定液中的腦組織樣本取出，常規(guī)脫水、透明、透蠟、包埋制成5 μm厚度的切片。取出烤好的切片，依次放入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，95%、85%、75%乙醇中浸泡脫蠟至水；抗原修復、過氧化氫孵育、山羊血清封閉后進行一抗孵育，4 ℃過夜；然后在37 ℃條件下滴加二抗，孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標記工作液，37 ℃環(huán)境下孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復染細胞核，切片經(jīng)過反藍后，再依次浸入濃度為75%、85%、95%的乙醇中脫水；封片；鏡檢；于400倍鏡下拍照。取其均值作為該組陽性細胞數(shù)。

1.5.4 丙二醛(MDA)含量檢測

根據(jù)MDA試劑盒說明進行樣本和試劑滴加，經(jīng)過吸光度測定后進行MDA含量測定。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均應用IBM SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。結果組間比較采用One-way ANOVA和Tukey’s檢驗，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 針刺對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

在各個時間點假手術組大鼠未見明顯神經(jīng)功能缺損。與假手術組比較，模型組大鼠1 d即表現(xiàn)出明顯神經(jīng)功能缺損(P<0.05)，3 d神經(jīng)功能缺損最重(P<0.05)，7 d神經(jīng)功能缺損有所恢復(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠在各時間點神經(jīng)功能缺損程度較模型組明顯減輕，結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠神經(jīng)功能評分在各時間點比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能Ludmila Belayev評分結果分)

2.2 針刺對腦出血大鼠神經(jīng)細胞線粒體形態(tài)的影響

各時間點假手術組神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)未見明顯改變。模型組1 d神經(jīng)元胞體中可見散在線粒體體積變小，線粒體嵴減少，線粒體外膜破裂，神經(jīng)元內細胞器略減少，神經(jīng)元胞體內可見類似脂質樣物質。模型組3 d神經(jīng)元內細胞器明顯減少，可見線粒體膜破裂，神經(jīng)元將近死亡。模型組7 d神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)有所緩解，但仍可見線粒體體積縮小，線粒體嵴減少和線粒體破裂。針刺組1 d與抑制劑組1 d神經(jīng)元線粒體形態(tài)改變不明顯，以腫脹為主。針刺組3 d與抑制劑組3 d較模型組3 d線粒體形態(tài)改變均減輕，可見散在線粒體形態(tài)變小，伴有線粒體雙層膜密度增厚及線粒體嵴減少或線粒體膜破裂,同時可見不同程度腫脹的線粒體。針刺組7 d與抑制劑組7 d線粒體形態(tài)基本趨于正常，偶有散在腫脹線粒體，見圖1～3。

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。 圖1 各組大鼠腦組織1 d時線粒體超微結構

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。圖2 各組大鼠腦組織3 d時線粒體超微結構

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。 圖3 各組大鼠腦組織7 d時線粒體超微結構

2.3 針刺對出血腦組織NeuN表達的影響

假手術組NeuN陽性細胞數(shù)相對較高，各時間點未見顯著差別(P>0.05)。與假手術組比較，NeuN陽性細胞數(shù)在模型組各時間點均顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，NeuN陽性細胞數(shù)在針刺組及抑制劑組各時間點均顯著增多(P<0.05)，見圖4,表2。

注：Scale bars:100 μm；藍色箭頭為NeuN陽性細胞表達。圖4 各組大鼠腦組織不同時間點NeuN表達比較

表2 各組大鼠腦組織NeuN相對表達量測定結果

2.4 針刺對出血腦組織MDA含量影響

與假手術組比較，模型組在出血后1 d、3 d、7 d MDA含量均顯著升高(P<0.05)。其中模型組1 d與3 d MDA含量，模型組3 d與模型組7 d MDA含量比較差異顯著(P<0.05)，說明腦出血后MDA含量在3 d達到高峰。針刺組大鼠各時間點MDA含量較同時間點模型組明顯減少，結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠MDA含量在各時間點比較，無顯著性差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織MDA測定結果

3 討論

鐵死亡是由鐵依賴性脂質過氧化驅動的一種程序性細胞死亡過程。細胞內的很多代謝途徑，如鐵代謝、脂質代謝、氨基酸代謝以及細胞呼吸等(即線粒體三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈)都是可以通過產(chǎn)生脂質活性氧[10]而與鐵死亡發(fā)生關聯(lián)。文獻表明鐵死亡的發(fā)生一定會伴有不同程度的線粒體形態(tài)和功能的改變[11]，包括線粒體嵴的減少，線粒體體積的減小甚至線粒體的破裂等[12-13]。在一定程度上鐵死亡的發(fā)生也與線粒體形態(tài)改變程度，能量供應和新陳代謝的損害嚴重程度有關。GAO等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸缺乏會導致線粒體膜電位超極化和脂質過氧化物積累，而抑制線粒體三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈可減輕線粒體膜電位過極化，減輕脂質過氧化物積累使細胞免于鐵死亡。目前線粒體功能失調已經(jīng)被認為是與鐵死亡相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要的生化特征[15]。而在腦出血后血腫溶解釋放大量游離鐵，可以驅動細胞活性氧的產(chǎn)生，線粒體作為氧化磷酸化的主要調節(jié)因子，是細胞內活性氧產(chǎn)生的主要來源。而線粒體活性氧(mitochondrial ROS,mitoROS)產(chǎn)生的主要來源是細胞內自由的具有氧化還原性的鐵池。研究表明一旦mitoROS聚積，便可與線粒體膜中的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生反應，導致脂質過氧化、線粒體DNA(mitochondrial DNA ,mtDNA)損傷，以及電子傳遞鏈復合物mtDNA編碼亞基的缺陷[16]。鐵死亡誘導劑愛拉斯汀(Erastin)已經(jīng)被證實會使mitoROS積累，線粒體通透性轉換孔開放，線粒體膜電位改變以及線粒體ATP耗竭、線粒體碎裂[17]。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)模型組1 d開始神經(jīng)元胞體中即可見散在線粒體雙層膜密度增加，線粒體體積變小，線粒體嵴減少。模型組3 d神經(jīng)元死亡明顯，神經(jīng)元胞體中可見線粒體嵴消失，線粒體破裂，以及神經(jīng)元死亡。模型組7 d神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)有所緩解。而在不同時間點針刺組與抑制劑組較模型組線粒體形態(tài)改變均較輕，可見散在線粒體形態(tài)變小，線粒體嵴減少，偶有線粒體外膜增厚及破裂,多數(shù)以腫脹線粒體為主?？梢娽槾淘谝欢ǔ潭壬蠝p輕了神經(jīng)細胞鐵死亡相關的線粒體形態(tài)損傷。另外在本實驗中我們觀察了神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)的表達，發(fā)現(xiàn)在腦出血后，NeuN陽性細胞數(shù)在各時間點均顯著減少(P<0.05)，3 d減少最顯著(P<0.01)，說明在腦出血后存活神經(jīng)元減少，3 d時存活的神經(jīng)元最少。與模型組比較，NeuN陽性細胞數(shù)在針刺組及抑制劑組各時間點均顯著增多(P<0.05)，可見針刺與鐵死亡抑制劑均可在一定程度上，減輕神經(jīng)元鐵死亡發(fā)生。同時本實驗還進一步觀察了MDA水平。發(fā)現(xiàn)腦出血后各時間點MDA水平均顯著升高(P<0.05)，3 d最高。而針刺組與抑制劑組大鼠各時間點MDA含量較同時間點模型組明顯減少。由此我們推測針刺可能在影響神經(jīng)細胞鐵死亡脂質過氧化方面起到積極作用。

頭針針刺在改善腦出血后神經(jīng)功能方面已經(jīng)得到廣大醫(yī)學工作者的認可[18]。其中“百會”透“曲鬢”針刺法在減輕腦出血后繼發(fā)性病理損傷過程起到舉足輕重的作用，其中包括抑制神經(jīng)細胞死亡信號傳導[19]。百會向曲鬢穴透刺，可以激發(fā)督脈、手足陽經(jīng)經(jīng)氣流注于足少陽膽經(jīng)。陽主動，一身之陽氣的激發(fā)可以有助于神經(jīng)細胞的激活，神經(jīng)功能的修復[20]。另外通過針刺對大鼠腦出血后不同時段腦內血腫中心等區(qū)域神經(jīng)細胞放電情況研究發(fā)現(xiàn)[21]，針刺能夠縮短出血后神經(jīng)元誘發(fā)放電潛伏期，增加放電頻率，改善細胞狀態(tài)，緩解神經(jīng)細胞的病理損害過程，并且針刺在清除血腫引起的神經(jīng)細胞抑制性泛化方面也起到積極作用。另外針刺也可以降低家兔腦出血組織脂質過氧化產(chǎn)物LPO含量[22]。在本實驗中，我們使用Ludmila Belayev評分評價各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，發(fā)現(xiàn)模型組自出血后1 d開始即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，在隨后的時間點缺損程度逐漸遞增，直至7 d有所緩解。而經(jīng)過針刺和抑制劑治療后的大鼠在各時間點神經(jīng)功能缺損程度較模型組明顯減輕。由此推測針刺可能通過抑制出血后腦組織神經(jīng)細胞鐵死亡促進神經(jīng)功能修復。

本研究雖然初步證實了針刺對出血后腦組織神經(jīng)元鐵死亡的相關線粒體形態(tài)、NeuN表達和MDA水平的影響，但由于線粒體在鐵死亡中的具體作用還存在爭議[23]，針刺是否通過改善線粒體形態(tài)就能抑制鐵死亡的發(fā)生以及發(fā)生鐵死亡的神經(jīng)細胞是如何引起線粒體形態(tài)改變的具體機制還有待于進一步研究。另外本研究主要針對線粒體的形態(tài)進行了觀察，還有一些線粒體代謝相關的調節(jié)因子如線粒體脂代謝調節(jié)因子(ASCF2和CS)、谷氨酰胺代謝相關因子即(mitochondrial glutaminase 2，GLS2)[24]、TCA周期相關因子(即FH)等也會增強對鐵死亡的敏感性[14]。后續(xù)會深入基因水平進行研究，進一步明確針刺對神經(jīng)細胞鐵死亡影響的作用機制。