基于腸道菌群探討清腸栓治療UC的作用機制

溫紅珠，戴小玲，林江

(上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性自身免疫性疾病，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)；屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一種。隨著社會經濟的發(fā)展，人們飲食結構及生活習慣的改變，UC的發(fā)病率逐年上升。研究者預測至2025年，中國IBD患者人數(shù)將達到150萬人[1]。UC遷延難愈，世界衛(wèi)生組織將其定為難治性疾病。清腸栓是上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院的院內制劑，具有清熱除濕，活血化瘀止血的功效，主要由青黛、三七、馬齒莧等藥物組成。前期研究表明清腸栓治療輕中度UC的臨床有效率高達91.49%[2]，最近的機制研究[3]發(fā)現(xiàn)清腸栓治療UC與下調腸道TLR4表達，抑制NF-κB 活化有關。本實驗通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)造模大鼠糞菌液灌腸以及菌株體外培養(yǎng)的方法，探討清腸栓對于紊亂腸道菌群是否有直接調節(jié)作用，并探討其與NF-κB通路的關系。

1 實驗材料

1.1 菌株

兩歧雙歧桿菌(編號：1.5029)和多形擬桿菌(編號：1.5132)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 實驗動物

健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠24只，4～6周齡，體質量(200±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證編號為SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于復旦大學實驗動物科部SPF級動物房。

1.3 實驗藥物

DSS購自MP公司，分子質量:36 000～50 000，產品貨號:160110。清腸栓組方煎劑主要組成：馬齒莧、五倍子、青黛、三七。由龍華醫(yī)院藥劑科提供，高壓蒸汽滅菌后備用。模型糞菌液：將DSS造模成功大鼠新鮮糞便置于無菌藥碗中，根據(jù)相關參考文獻[4]按照1∶6(W∶V)的比例加入無菌0.9%生理鹽水進行初步均質加工；接著使用無菌壓舌板攪拌5 min后靜置5 min；然后逐級經過2層、4層、8層無菌紗布過濾以去除未吸收的食物殘渣和小顆粒物質，得到糞菌液，轉至-30 ℃保存，1周內使用。清腸栓糞菌液：清腸栓組方煎劑高壓蒸汽消毒后使用，將新鮮獲得的DSS造模大鼠糞便按照1∶6(W∶V)比例加入煎劑，攪拌混勻，逐層濾過后，轉至-30 ℃保存，1周內使用。

1.4 主要試劑及儀器

數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)GBOX/CHEMI-XT4(英國Syngene公司)，包埋機(德國LEICA公司)，自動脫水機(德國LEICA公司)，切片機(德國LEICA公司)，高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO公司)，低溫冰箱(日本SANYO公司)，OLYMPUS-ix71顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，伊紅及蘇木素試劑(批號：140410，上海億欣生物科技有限公司)，兔抗β-actin多克隆抗體(批號：#8457，Cell Signal Technology)，兔抗鼠TLR4多克隆抗體(批號：990394W，Bioss公司)，兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(批號：#8242，Cell Signal Technology)。血平板(批號：20200912，上海科馬嘉生物有限公司)，培養(yǎng)箱(賽默飛二氧化碳培養(yǎng)箱)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備

將24只動物適應性飼養(yǎng)1周后稱重，根據(jù)體質量由小到大編號，采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件，按照動物體質量進行隨機分組，將動物分至以下4組：正常組(N)、DSS造模組(M)、模型糞菌液灌腸+DSS造模組(M1)、清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組(M2)。DSS模型制備：稱取適量的DSS加入雙蒸水，搖晃混勻溶解，制成5%(W/V)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；給予大鼠自由飲用7 d造模，期間禁水不禁食。

2.2 給藥方法

經肛灌腸，動物灌腸前12 h禁食不禁水。將大鼠四肢及頭部固定在模板上，使用膠皮管，插入大鼠直腸約5 cm，用注射器緩慢注入37 ℃左右的糞菌液/生理鹽水，灌完后拔出，夾子夾閉大鼠肛門；隨后將大鼠倒置15 min。

2.3 樣本的采集及制備

給予大鼠戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)腹腔注射深度麻醉后，腹部朝上置于無菌紙上，四肢固定，以75%乙醇擦拭腹部皮毛后自腹中部剪開皮膚，充分暴露腹壁，剪取肛門至回盲部的全部結腸，首先使用小鑷子分離清除掉結腸表面的脂肪組織，然后使用小剪刀沿腸系膜邊緣縱行剪開結腸，多次置于0.9%的冰生理鹽水中涮洗干凈，最后將結腸平展于濾紙上吸干水分，留取大約2 cm長度的遠端結腸(組織，輕輕平展于濾紙上，以大頭針固定兩端，置于4%甲醛溶液固定。剩余結腸置于液氮中速凍后在-80 ℃保存，備Western blot檢測用。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 血平板菌落計數(shù)

3.1.1 兩歧雙歧桿菌計數(shù)

菌株復蘇后，置于血平板培養(yǎng)48 h；然后分別取2.5%、5%、10%清腸栓組方煎劑、清腸栓組方煎劑原液和純水各10 mL，加入兩歧雙歧桿菌制成含108菌液，使用接種環(huán)在血平板上涂10 μL的菌液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。隨著煎劑濃度的增加，兩歧雙歧桿菌的菌落數(shù)亦見升高；與純水培養(yǎng)組相比較，清腸栓組方煎劑原液培養(yǎng)組的兩歧雙歧桿菌的菌落數(shù)出現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的升高(P<0.01)，見表1。

表1 各濃度清腸栓組方煎液的菌落計數(shù)

3.1.2 多形擬桿菌計數(shù)

菌株復蘇后，置于血平板培養(yǎng)72 h；然后分別取2.5%、5%、10%清腸栓組方煎劑、清腸栓組方煎劑原液和純水各10 mL，加入多形擬桿菌制成含108的菌液，使用接種環(huán)在血平板上涂10 μL的菌液，置于培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72 h后計數(shù)。隨著煎劑濃度的增加，多形擬桿菌的菌落數(shù)亦見升高；與純水培養(yǎng)組相比較，清腸栓組方煎劑原液培養(yǎng)組的多形擬桿菌的菌落數(shù)均見具有統(tǒng)計學意義的升高(P<0.01)，見表2。

表2 各濃度清腸栓組方煎液培養(yǎng)組的菌落計數(shù)

3.2 動物疾病活動指數(shù)

從造模第1天開始，每日觀察并記錄大鼠的毛色、精神狀態(tài)、活動度、糞便性狀、隱血及肉眼血便等情況，按照相關參考文獻[5]表3進行疾病活動指數(shù)(Disease activity index,DAI)評分，根據(jù)體質量下降、糞便性狀及隱血情況評分計算每只大鼠的DAI值，以評估其疾病活動情況。

表3 DAI評分標準

給藥7 d后，與模型糞菌液灌腸+DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組間的DAI評分出現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。與DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組間的DAI評分升高趨勢(P>0.05)，見表4。

表4 各組DSS大鼠DAI評分的比較(分)

3.3 結腸組織病理學觀察

制備結腸組織石蠟切片，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察大鼠結腸黏膜情況，并參照DIELEMAN等人[6]的組織學損傷評分(histological index,HI)表評估結腸損傷情況評分。與DSS造模組相比較，模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分顯著升高(P<0.05)，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分出現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。與模型糞菌液灌腸+DSS造模組相比，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分顯著下降(P<0.01)，見表5。

表5 各組大鼠HI評分的比較

3.4 結腸TLR4、NF-κB表達的測定

從各組大鼠結腸標本中隨機選取3個樣本并提取組織總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定濃度，制備膠，啟動凝膠電泳(100 V/90 min)轉膜后加入一抗、二抗進行孵育，凝膠成像系統(tǒng)顯影，應用圖象分析系統(tǒng)分析底片中的目的條帶，計算機自動讀取并記錄每條帶的密度值。與正常組相比較，DSS組、模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結腸TLR4/NF-kB顯著升高(P<0.01)；與DSS組比較，模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結腸TLR4顯著升高(P<0.05)、NF-kB升高(P>0.05)，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結腸TLR4/NF-kB下降(P>0.05)；與模型糞菌液灌腸+DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結腸TLR4/NF-kB顯著下降(P<0.05)，見表6、圖1。

表6 各組DSS大鼠結腸TLR4、NF-κB的比較

注：N.正常組；D.DSS造模組；M.模型糞菌液+DSS造模組；Q.清腸栓糞菌液+DSS造模組。圖1 各組大鼠結腸TLR4和NF-kB蛋白表達

4 討論

UC是炎癥性腸病的一種，屬于自身免疫性疾病，其病因復雜多樣，目前主要認為與免疫、遺傳和環(huán)境等多種因素相關。UC臨床癥狀以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主，組織病理學檢查主要表現(xiàn)為黏膜及黏膜下層炎癥和潰瘍形成。中醫(yī)學雖然沒有UC病名，但根據(jù)歷代醫(yī)籍中記載的“腸澼”“下利”“久痢”“休息痢”“滯下”等對病名的解釋以及對其臨床表現(xiàn)的描述，我們不難將這些病名與UC聯(lián)系起來。

清腸栓是上世紀八十年代中期，上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院上海市名老中醫(yī)馬貴同教授在中醫(yī)理論指導下，結合多年的臨床與科研經驗，針對國人UC發(fā)病的主要病理因素及發(fā)病特征，抓住濕、熱、毒、瘀四個主要病邪，以清熱除濕、活血化瘀為治療法則，同時根據(jù)傳統(tǒng)瘡瘍科制劑的用藥特點，選用青黛、三七、馬齒莧等中藥制成的直腸給藥制劑。方中馬齒莧酸寒無毒，歸肝、大腸經，有清熱解毒、除濕止痢、涼血止血之功?！侗静菥V目》記載:“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋”。青黛歸肝、肺、胃經，性咸寒，長于清熱解毒，用于清腸胃之邪熱，力專而效宏；《本草正義》有青黛“治瘟疫熱毒發(fā)狂……癰瘍腫毒”的記載。三七甘微苦溫無毒，善止血活血定痛，祛腐生?。荒芡ㄒ嗄苎a；具有止血不留瘀血，行血不傷新的優(yōu)點，《本草綱目》記載其能治療“赤痢血痢”。五倍子酸平無毒，歸肺、大腸、腎經，澀腸止血，解毒止瀉之功。《本草綱目》記載其可療“瀉痢不止”“脾瀉久痢”。全方以馬齒莧、青黛清熱解毒，除濕愈潰，共為君藥；三七活血化瘀、祛腐生肌，并止血而不留瘀，為臣藥；五倍子收斂固澀，助青黛、三七收斂潰瘍瘡口而不留邪，為佐使藥。

腸道菌群是指在人體腸道中與人體共生的微生物，腸道菌群紊亂是近年來有關UC病因的研究熱點。正常情況下，腸道內有大量的免疫細胞，使腸道處于一種“生理性”的慢性炎癥狀態(tài)；UC患者的這種調控過程出現(xiàn)異常，腸道黏膜免疫功能失調，這種黏膜免疫系統(tǒng)的慢性激活可能是對某種感染因子的適度反應，但至今尚未找到這樣一種感染因子，且UC高發(fā)的國家的感染性腸病的發(fā)病率卻很低。所以，目前主要認為UC的發(fā)病是針對機體腸道菌群的過度免疫應答引起的一種病理性炎癥狀態(tài)。腸道菌群在UC中的作用，并不表現(xiàn)為某種特定的腸道微生物引起疾病，而是作為一個整體，通過改變腸道微生態(tài)的穩(wěn)態(tài)參與UC的發(fā)生發(fā)展[7]；有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群參與UC的機制可能與TLR/NF-κB信號通路過度激活有關[8]。本研究發(fā)現(xiàn)DSS造模大鼠糞菌結構與正常大鼠不同，這與2012年SAMANTA等人[9]的研究結果一致。而在DSS造模同時，給予DSS造模動物的糞菌液灌腸可上調DSS造模大鼠結腸TLR4、MYD88和NF-κB蛋白表達，這表明腸道菌群紊亂對NF-κB通路過度激活可能確實有促進作用。

兩歧雙歧桿菌和多形擬桿菌均屬于益生菌，研究表明兩歧雙歧桿菌[10]和多形擬桿菌[11]均可誘導DSS結腸炎緩解，其作用機制與調節(jié)DSS模型的腸道微生態(tài)失調，抑制NF-κB信號通路和促炎細胞因子表達等有關。本研究采用體外研究發(fā)現(xiàn)清腸栓有促進兩歧雙歧桿菌和多形擬桿菌生長的作用。而動物研究發(fā)現(xiàn)與DSS造模+模型糞菌液灌腸組比較，予清腸栓煎劑干預處理后的模型糞菌液灌腸，則動物的HI評分顯著下降，DAI有下降趨勢。但與DSS造模組相比的HI評分和DAI評分則僅有下降趨勢，表明清腸栓組方治療UC可能與促進了腸道菌群紊亂的恢復有關。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，在DSS造模同時，給予動物模型糞菌液灌腸或清腸栓煎劑干預處理后的模型糞菌液灌腸，清腸栓糞菌液灌腸組大鼠結腸組織的TLR4和NF-κB蛋白表達與模型糞菌液灌腸組比較，均出現(xiàn)顯著下降，表明清腸栓可能通過調整腸道微生態(tài)平衡，進而抑制NF-κB通路的過度激活，抑制炎癥細胞因子分泌，從而起到治療UC的作用。