六君安胃方對(duì)化療相關(guān)黏膜炎小鼠小腸干細(xì)胞增殖與Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

趙娜，楊宇飛，裴曉華，楊斌，閆韶花，何斌*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

細(xì)胞毒性化療是目前治療惡性腫瘤的主要手段之一。化療藥物殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，損傷機(jī)體代謝較快的消化道黏膜，引起化療相關(guān)黏膜炎[1](chemotherapy-induced mucositis,CIM)，累及口腔、胃腸道黏膜，可導(dǎo)致口腔疼痛、惡心嘔吐、腹瀉等癥狀[2]。在接受氟尿嘧啶治療的人群中，胃腸道黏膜炎導(dǎo)致的腹瀉發(fā)生率高達(dá)80%[3-4]，嚴(yán)重影響患者的依從性和化療期間生活質(zhì)量[5]。因此對(duì)CIM有效干預(yù)使患者順利完成化療，對(duì)惡性腫瘤的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療有較大的意義。

六君安胃方是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤診療部楊宇飛教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床廣泛應(yīng)用于減輕化療期間消化道副反應(yīng)，其對(duì)結(jié)腸癌輔助化療的協(xié)同作用研究已獲得2017年國(guó)家科技部重大專項(xiàng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究立項(xiàng)資助。本團(tuán)隊(duì)前期門診病歷回顧性分析表明，六君安胃方緩解化療期間消化道癥狀的有效率達(dá)80%以上。六君安胃方起效的可能機(jī)制是通過中醫(yī)健脾和胃法減輕化療所致的胃腸黏膜損傷，促進(jìn)黏膜修復(fù)，從而改善臨床癥狀。本研究旨在觀察六君安胃方對(duì)氟尿嘧啶誘導(dǎo)小鼠化療相關(guān)黏膜炎的防治作用，探索其對(duì)小鼠小腸干細(xì)胞增殖和Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫24 ℃，相對(duì)濕度(60±5)%，12 h白夜交替，自由飲水進(jìn)食,本實(shí)驗(yàn)方案通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物

六君安胃方(已申請(qǐng)專利)以太子參、炒白術(shù)、陳皮、姜半夏等組成，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科提供。陽(yáng)性對(duì)照藥蒙脫石散，浙江海利生制藥有限公司，批號(hào)：200333；造模藥物氟尿嘧啶注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2003201。

1.3 試劑及儀器

5-溴-2’-脫氧尿苷(5-Bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)(sigma，貨號(hào)：B9285);免疫組化一抗Lgr5(abcam，貨號(hào)：ab219107)，Brdu( proteintech，貨號(hào)：66241-1-Ig)，Wnt( proteintech，貨號(hào)：55184-1-AP)，β-Catenin(proteintech，貨號(hào)：17565-1-AP) 。組織切片機(jī) (Leica RM2235，德國(guó))，顯微鏡(Olympus BX51，美國(guó))。

2 方法

2.1 分組及造模

60只C57BL/6J雄性小鼠按體質(zhì)量分層，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、蒙脫石散組、六君安胃高、中、低劑量組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參照文獻(xiàn)[6-8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備CIM模型，造模方法為氟尿嘧啶注射液50 mg/kg，腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d(第8天至第14天)。小鼠體質(zhì)量下降伴有腹瀉結(jié)合鏡下小鼠小腸組織病理觀察驗(yàn)證造模成功[9]。正常對(duì)照組小鼠等量生理鹽水腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 干預(yù)

六君安胃方和蒙脫石散用量根據(jù)人-小鼠等效劑量換算[10],具體劑量為中藥高劑量組15.66 g/kg、中劑量組為7.83 g/kg、低劑量為3.92 g/kg，灌胃，每日1次；陽(yáng)性對(duì)照蒙脫石散組劑量為1.85 g/kg，灌胃，每日1次；正常對(duì)照組與模型組等量無菌水灌胃，連續(xù)14 d(第1天至第14天)。小鼠腹腔注射BrdU溶液50 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d(第12天至第14天)標(biāo)記干細(xì)胞增殖。第15天斷頸處死后取小腸，置入4%多聚甲醛溶液固定24 h。

2.3 體質(zhì)量、腹瀉評(píng)分及小腸長(zhǎng)度

造模后每天上午9點(diǎn)測(cè)小鼠體質(zhì)量。小鼠體質(zhì)量變化率計(jì)算：(當(dāng)天體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量×100%。造模后每天上午9時(shí)將小鼠抓握后查看大便和肛門周圍情況，依據(jù)腹瀉評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)確定是否有腹瀉及腹瀉嚴(yán)重程度[11]，腹瀉評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下。0分：大便正常；1分：輕度腹瀉(微濕軟大便)；2分：中度腹瀉(濕大便和不成形大便，肛周被毛中度染色)；3分：重度腹瀉(水樣大便，肛周被毛重度染色)。計(jì)算各組小鼠腹瀉評(píng)分均值作為比較。第15天斷頸處死后分離胃末端至盲腸起始端之間小腸，用卡尺測(cè)量小腸長(zhǎng)度。

2.4 空腸黏膜形態(tài)學(xué)

固定后小鼠空腸組織梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色后在顯微鏡50倍下觀察空腸黏膜結(jié)構(gòu)。在400倍下找到絨毛及隱窩結(jié)構(gòu)，用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)量絨毛高度和隱窩深度，每個(gè)切片選取5個(gè)視野，均值表示該小鼠的絨毛高度和隱窩深度。

2.5 小鼠空腸組織免疫組化檢測(cè)Lgr5+、BrdU+細(xì)胞，Wnt、B-catenin蛋白表達(dá)

小鼠空腸組織石蠟切片至4μm，脫蠟及水化，3%雙氧水避光浸泡10 min封閉，檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復(fù)，一抗孵育(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適一抗?jié)舛萀gr5 1∶100、BrdU 1∶50、Wnt 1∶100、β-Catenin 1∶200)，4 ℃過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，自來水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。顯微鏡400倍下每切片選取5個(gè)視野，用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定隱窩結(jié)構(gòu)目標(biāo)蛋白Lgr5+、BrdU+細(xì)胞數(shù)和Wnt、B-catenin積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量、腹瀉評(píng)分及小腸長(zhǎng)度

正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠造模第2天(d9)開始體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，程度日漸嚴(yán)重。與模型組相比六君安胃組小鼠體質(zhì)量下降程度輕，造模第7天時(shí)(d14)高、中劑量組小鼠體質(zhì)量下降程度顯著減輕(P<0.05),見圖1。

注：與正常對(duì)照組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

正常對(duì)照組小鼠大便正常，模型組小鼠造模第3天(d10)開始腹瀉，腹瀉評(píng)分高(P<0.05),程度逐漸加重。與模型組相比，蒙脫石散組和六君安胃組腹瀉程度有減輕趨勢(shì)，但評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖2。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠小腸明顯縮短(P<0.01)，而六君安胃組小鼠小腸無縮短，較模型有顯著差異(P<0.01)，見圖3。

注：與正常對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組小鼠腹瀉評(píng)分比較

注：與正常對(duì)照組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。圖3 各組小鼠小腸長(zhǎng)度比較

3.2 空腸黏膜形態(tài)學(xué)

正常對(duì)照組絨毛、隱窩結(jié)構(gòu)清楚、完整，絨毛緊密排列，表面上皮細(xì)胞無變性、壞死及脫落，黏膜下層、肌層完整，外膜清晰可見，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組相比，模型組絨毛高度縮短、萎縮(P<0.01)，絨毛間距寬，上皮細(xì)胞變性、壞死及脫落，腺體輕度減少，黏膜下層充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩結(jié)構(gòu)破壞變淺(P<0.01)，肌層平滑肌排列輕度無序，全層厚度變薄。與模型組相比，六君安胃組絨毛高度高(P<0.05)，絨毛間距短，局部表面上皮細(xì)胞輕度變性，未見萎縮、壞死、脫落，腺體減少不明顯，隱窩破壞較輕，隱窩深(P<0.05)，黏膜下層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層排列較為規(guī)整。其中，高劑量療效最好，見圖4。各組絨毛高度與隱窩深度見表1。

圖4 各組小鼠空腸組織形態(tài)學(xué)(HE染色，×50)

表1 各組小鼠空腸黏膜絨毛、隱窩比較

3.3 隱窩結(jié)構(gòu)Lgr5+、BrdU+細(xì)胞及Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組隱窩結(jié)構(gòu)清晰，Lgr5、BrdU主要表達(dá)于隱窩底部，Wnt及β-catenin從隱窩底部到絨毛頂部逐漸遞減，本次實(shí)驗(yàn)僅觀察和統(tǒng)計(jì)隱窩結(jié)構(gòu)染色。與正常對(duì)照組相比，模型組隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)量明顯減低(P<0.01)。與模型組相比，六君安胃組表達(dá)量增高，且高劑量組療效最佳。高劑量組的Lgr5+、BrdU+細(xì)胞數(shù)顯著增高(P<0.05);高、中劑量組Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)量較模型組明顯高(P<0.05)，見圖5、表2。

圖5 各組小鼠空腸黏膜Lgr5、BrdU、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)(免疫組化，×200)

表2 各組小鼠空腸黏膜Lgr5+細(xì)胞，BrdU+細(xì)胞，Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)

4 討論

腸道黏膜損傷后的修復(fù)依賴于隱窩底部的腸干細(xì)胞增殖。腸干細(xì)胞經(jīng)多次分裂后分化為多種不同種類的腸上皮細(xì)胞，從隱窩底部向上遷移，以補(bǔ)充更新?lián)p傷的上皮細(xì)胞。腸干細(xì)胞中標(biāo)志性表達(dá)Lgr5的隱窩柱狀干細(xì)胞，自身保持高度的增殖能力，是腸上皮更新的驅(qū)動(dòng)力[12-15]。本研究中用Lgr5標(biāo)記隱窩底部腸干細(xì)胞，用核苷類似物BrdU，使其與胸腺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)性整合到DNA中，標(biāo)記干細(xì)胞的增殖。免疫組化結(jié)果表明，經(jīng)六君安胃方干預(yù)后小腸隱窩結(jié)構(gòu)中Lgr5+和BrdU+細(xì)胞數(shù)較模型組顯著增多；病理形態(tài)觀察到六君安胃組腸黏膜絨毛高度高、隱窩深，絨毛間距短，局部表面上皮未見萎縮、壞死、脫落，小腸黏膜上皮損傷較輕；體質(zhì)量下降和小腸縮短程度均較模型組減輕。提示六君安胃方能促進(jìn)腸干細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步促進(jìn)損傷黏膜上皮的修復(fù)，改善小鼠一般情況。而Wnt/β-catenin調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)腸干細(xì)胞自我更新和分化，保障腸干細(xì)胞增殖和維持[16-17]，是腸道損傷后修復(fù)所必須的信號(hào)通路[18]。Wnt配體與膜受體結(jié)合后抑制β-catenin降解，β-catenin在胞質(zhì)中聚集并易位到細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用以激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]，Wnt的靶基因包括Lgr5、Cyclin D1等，其中Cyclin D1促進(jìn)細(xì)胞增殖，Lgr5使腸干細(xì)胞保持其干性[20]。本研究免疫組化結(jié)果表明，六君安胃干預(yù)后隱窩結(jié)構(gòu)中Wnt蛋白和β-catenin蛋白的表達(dá)較模型組顯著增高，提示六君安胃方對(duì)腸干細(xì)胞增殖的作用與其上調(diào)Wnt/β-catenin通路的蛋白表達(dá)有關(guān)。

六君安胃方以《醫(yī)學(xué)正傳》中的六君子湯為基礎(chǔ)，緊扣化療期間惡心嘔吐、腹脹腹瀉為表現(xiàn)的“脾胃不和”病機(jī)，加之對(duì)化療這特殊時(shí)期易導(dǎo)致氣陰兩虛的“因時(shí)”考慮，太子參易黨參，益氣養(yǎng)陰；陳皮、姜半夏理氣和胃止嘔，炒白術(shù)、茯苓健脾化濕止瀉，全方共奏益氣養(yǎng)陰、健脾和胃功效。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，六君安胃方能改善CIM小鼠一般情況，減輕小腸黏膜損傷，其可能機(jī)制是通過上調(diào)Wnt/β-catenin通路蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腸上皮損傷的修復(fù)。本研究探索了六君安胃方減輕化療所致胃腸道副反應(yīng)的機(jī)制，但腸道環(huán)境復(fù)雜，腸道微生物在其中的作用不可忽視。腸道菌群在中藥與Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的腸干細(xì)胞增殖中起到什么作用需要進(jìn)一步深入研究。