造血干細胞體外擴增

楊超逸

（內(nèi)蒙古大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

造血干細胞是一類能夠自我更新并具有分化成所有造血譜系細胞潛能的成體干細胞。造血干細胞在機體內(nèi)通過自我更新可以維持機體內(nèi)自身數(shù)量穩(wěn)定，成熟分化則支持機體的終身造血。上述干性功能的維持受特殊造血微環(huán)境的網(wǎng)絡調(diào)控。除此之外造血干細胞具有移植在體內(nèi)長期重建各系造血和免疫功能。而造血干細胞的主要來源分為骨髓血、外周血和臍帶血、胎盤。造血干細胞移植是各種血液腫瘤、再生障礙性貧血癥、重度地中海型貧血癥以及一些先天性免疫缺乏癥或代謝性疾病的根本治療手段。HSCT是將自體或者異體供者的HSCs 移植入受者體內(nèi)以進行長期重建各系造血功能和免疫系統(tǒng)。HSCT 主要包括骨髓移植、外周血干細胞移植、臍血干細胞移植。其中臍帶血是上述三種方法中造血干細胞含量最為豐富的。盡管如此，一份臍帶血存儲的有核細胞也僅為3.0×108 左右，據(jù)了解，對應1公斤體重的人需要使用2.0×107 的臍帶血有核細胞。因此一份臍帶血造血干細胞僅能夠支持體重在15 公斤左右的患者的移植治療?；颊唧w型較大會限制其使用，同時也會導致造血功能恢復時間的延長，感染等并發(fā)癥發(fā)生率增高，患者移植相關(guān)死亡率增加。這也成為造血干細胞臨床應用的一個主要瓶頸。為解決這一難題，科學家們致力于力求體外擴增HSCs 數(shù)量，挽救更多的血液病患者。體外長期擴增培養(yǎng)臍帶血造血干細胞的研究日益受到重視，但是目前為止造血干細胞干性維持狀態(tài)下體外有效擴增仍然是一個科學難題,在體外培養(yǎng)環(huán)境中很難獲得大量擴增。近年來多項基礎及轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，細胞生長因子混合物、與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)及加入小分子化合物激動劑等具有人臍帶血造血干細胞體外擴增作用。

一、造血干細胞簡述

造血干細胞是具有自我更新能力及分化為所有成熟造血細胞譜系潛能的多能成體干細胞。HSCs 位于造血系統(tǒng)級聯(lián)的頂端,在造血細胞譜系分化過程中,HSCs 首先失去自我更新能力,然后逐步丟失多能性,最終成為紅細胞、血小板、粒細胞、DC 細胞、B 細胞、T 細胞及NK 細胞等有特定功能的成熟細胞類型。眾多信號通路及調(diào)控因子的遺傳學與表觀遺傳學網(wǎng)絡型調(diào)控在HSCs 的命運決定、細胞死亡和存活、細胞分裂或靜息、細胞分化或自我更新、極性和遷移或定居等各種生物學行為中起重要作用。正常的生理條件下,機體內(nèi)HSCs 幾乎不分裂,主要處于靜息和休眠狀態(tài),只有一小部分HSCs 參與特定階段的活躍的造血生成。

二、小分子化合物在造血干細胞調(diào)控中的研究進展

（一）小分子化合物的定義及其作用特點

小分子化合物指相對分子質(zhì)量小于10000 的化合物。在干細胞體外培養(yǎng)中，一些小分子化合物顯示了它們的獨特優(yōu)勢。首先，化合物的作用效果可以通過調(diào)節(jié)化合物的結(jié)構(gòu)、濃度來改變，其過程簡單可控；其次，小分子化合物相較于細胞因子或轉(zhuǎn)錄因子等性質(zhì)更為穩(wěn)定，化合物的前期處理以及給藥非常方便[5]。

（二）多糖類物質(zhì)對造血干細胞的調(diào)控

多糖類物質(zhì)可以在胰高血糖素的作用下影響HSCs 歸巢等活動信號通路，如wnt／B.catenin 信號通路、P13K／AKT 信號通路和活mTOR 信號通路等的靶基因表達，進而于維持HSC自我更新能力，提高HSC的歸巢能力，使HSC 顯著擴增。

（三）GSK－3β 抑制劑BI0

其對HSC 細胞自我更新的影響可能是由于mTOR 信號通路的激活而受到抑制；c—MPL 小分子激動劑NR.101、5-氮脫氧胞苷和組蛋白去乙?；敢种苿┒际峭ㄟ^減緩細胞周期進程，從而促進HSC 的自我更新.

（四）TEPA 銅螯合劑

可以螯合細胞內(nèi)的銅離子，進而降低細胞內(nèi)銅的水平，促進HSC 自我更新；丙戊酸(vPA)和二乙基氨基苯甲醛(DEAB)可抑制HSC 分化；SIRTl可以促進HSC 歸巢；前列腺素E2(PGE2)、Caspase 抑制劑及鈣蛋白酶抑制劑和血清素可以抑制HSC 凋亡。

（五）與氧化相關(guān)的小分子化合物對造血干細胞的調(diào)控

氧濃度是參與造血細胞發(fā)育微環(huán)境中的最主要的因素，低氧環(huán)境能夠降低活性氧的產(chǎn)生，使HSC 處于靜息狀態(tài)，HSC 表達，從而更好地維持了HSC 的遷移能力。有文獻報道，抗氧化劑可通過消除ROS 提高HSC 的功能，進而改善HSC 移植存活率。目前，已發(fā)現(xiàn)的與HSC 調(diào)控相關(guān)的抗氧化小分子有N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑TSA/5azad、SIRT1激動劑白藜蘆醇、咖啡酸苯乙酯CAPE、丙戊酸VPA、尼克酰胺NAM、抗壞血酸磷脂酸鹽AA2P 等。

（六）UM171

UM171 是一種高效的HSCs 再生小分子激動劑，可以增強人造血干/祖細胞的體外自我更新。UM171 對體外培養(yǎng)細胞的分裂速率沒有影響，但可以促進細胞CD34+CD45RA-表型的維持，同時可以減少與紅系和巨核細胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達。最近研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)UM171 處理的細胞中，PROCR 基因顯著上調(diào)。同時，UM171 在人類多能干細胞衍生造血祖細胞方面也具有巨大潛力。

三、氧氣濃度對HSCs 體外擴增的影響

在HSCs 體外培養(yǎng)過程中，為了能更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，氧濃度和小分子物質(zhì)是需要考慮到的重要影響因素。其中氧濃度是造血干細胞體外培養(yǎng)環(huán)境和體內(nèi)造血微環(huán)境中的重要物化參數(shù)，常用的體外培養(yǎng)體系中的氧濃度一般可以高達21%，而體內(nèi)骨髓造血微環(huán)境中的氧濃度只有1－6%左右，兩者之間存在的這種顯著差別有可能對造血干細胞的擴増、分化和生理功能產(chǎn)生重要影響。以往的研究已經(jīng)證實，在體外某些特定的因子、信號能有效地促進HSCs 的擴增和自我更新。研究發(fā)現(xiàn)可以通過在培養(yǎng)基中添加小分子生物或者化學物質(zhì)來調(diào)節(jié)HSCs 的功能。周立萍博士的研究團隊選擇在CD34+細胞培養(yǎng)基中添加睪酮，腎上腺素，去甲腎上腺素這三種小分子物質(zhì)，并同時在常氧（20%）和低氧（1%）兩種氧濃度下培養(yǎng)，來觀察比較激素＋不同氧濃度這兩者相結(jié)合對HSCs 擴增，細胞表型，基因表達的影響，以此來探討一種更好的HSCs 體外培養(yǎng)條件。

四、模擬HSCs 骨髓微環(huán)境

（一）造血干細胞微環(huán)境

造血干細胞微環(huán)境是位于血管周圍靠近骨小梁區(qū)，由骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞組成的維持和調(diào)節(jié)HSCs 生理功能的局部組織微環(huán)境。在Niche 中，Niche 細胞通過粘附分子和膜表面信號分子來與HSCs 直接或間接接觸進而調(diào)控HSCs 的自我更新、增殖、分化等一系列生物學行為。[22]

（二）骨髓間充質(zhì)干細胞

骨髓間充質(zhì)干細胞，既往稱為骨髓基質(zhì)成纖維細胞,是一類起源于中胚層的成體干細胞,具有自我更新及多向分化潛能,可分化為多種間質(zhì)組織,如骨骼、軟骨、脂肪、骨髓造血組織等。骨髓BMSC 的遷移、定植、增殖與分化,需要從外界獲取信息。其分化方向取決于所在的微環(huán)境。這里的“微環(huán)境”不僅包括骨髓微環(huán)境,還包括局部間質(zhì)組織微環(huán)境。PMF患者骨髓微環(huán)境改變有:間質(zhì)細胞增多及發(fā)育異常的巨核細胞聚集、細胞外基質(zhì)蛋白增加,血管生成增加,竇狀隙擴張伴血管內(nèi)造血,骨硬化等。這種改變呈片狀分布,不同患者或同一患者不同部位骨髓改變有所不同。局部間質(zhì)組織微環(huán)境涉及多種因素骨髓基質(zhì)蛋白,細胞間、細胞與基質(zhì)間接觸,局部細胞、生長因子濃度及受體表達情況等。AMM 患者骨髓成纖維細胞是否由骨髓BMSC 分化而來，尚未明確。但研究發(fā)現(xiàn)骨髓微環(huán)境、BMSC 及造血干細胞間存在極其微妙的關(guān)系,這可能與PMF 發(fā)病有關(guān)。

（三）BMCS+細胞因子模擬骨髓微環(huán)境

目前已經(jīng)確定的能在體外有效擴增HSCs 的方法是在培養(yǎng)基中添加多種固定組合的造血細胞因子，能使HSCs 數(shù)量明顯增加，但擴增所得HSCs往往失掉了長期造血和重建免疫的功能。BMSC 是造血微環(huán)境中的重要組成部分，通過分泌多種造血細胞因子調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)，維持HSCs 的穩(wěn)定和功能，促進其擴增，增強其自我更新能力。

細胞因子組合和BMSC 的聯(lián)合應用使造血細胞明顯擴增，增殖迅速，且CD34+HSCs 的比例也明顯多于單獨使用細胞因子;同時，集落分析實驗顯示，以這種方式擴增的HSCs 在體外具有很強的集落形成能力，具有分化為各系造血細胞的能力。這表明MSCs 條件培養(yǎng)基和細胞因子組合相輔相承，條件培養(yǎng)基中豐富的細胞因子更進一步加強了細胞因子組合的擴增效應，同時也一定程度上維持了HSCs 的穩(wěn)定和功能。

五、表觀遺傳學修飾劑

造血干細胞的自我更新和分化受到高度協(xié)調(diào)的表觀遺傳調(diào)控，其中組蛋白乙酰化修飾可以激活或沉默基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白去乙?；敢种苿┛梢砸种圃煅杉毎薪M蛋白去乙?；傅幕钚?，增加組蛋白乙酰化水平。多種HDACIs，如曲古他汀A、丙戊酸鈉等，被用于在體外無血清培養(yǎng)中與細胞因子組合聯(lián)合處理造血干細胞，尤其是臍血造血干細胞，促進與干細胞自我更新相關(guān)的多能基因的轉(zhuǎn)錄表達，抑制分化相關(guān)基因的表達，從而促進造血干細胞擴增，抑制分化，獲得數(shù)量更多的長期重建細胞。

HDACIs 可以上調(diào)將早期HPCs 重編程為HSCs 的基因表達，這些與HSCs擴增和功能維持有關(guān)的基因在HSCs 培養(yǎng)過程中被沉默，組蛋白乙?；艽龠M這些基因表達。

羧酸類 HDACI 丙戊酸抑制類和a 類HDACs，能使CB-CD34+細胞表觀重編程，促進CB-HSCs 擴增。研究發(fā)現(xiàn)，含血清培養(yǎng)體系下VPA 處理HSCs 產(chǎn)生更多分化細胞，即大量祖細胞和短期重建細胞而非長期重建細胞。

六、小結(jié)

綜上所述小分子化合物誘導干細胞分化，對治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、成骨缺損等復雜的疾病有一定的臨床應用，以及在HSC 和白血病干細胞的調(diào)控中有著重大的作用。小分子化合物對促進HSC 的增殖以及調(diào)控白血病干細胞有著比較樂觀的應用前景，相比于細胞因子來講,小分子化合物具有來源易得,結(jié)構(gòu)明了,作用靶點和機制容易深入研究的優(yōu)勢。發(fā)現(xiàn)更多安全可靠的、無毒副作用的，可體外擴增HSC 或調(diào)控白血病干細胞的小分子化合物，對于解決人類的血液疾病及其他的一些疾病有著重大的意義。