GSDME通過p53、caspase3增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的紫杉醇敏感

高世華 李植鋒 蔡鍵鋒

肺癌根據(jù)組織形態(tài)學(xué)特征可分為小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞癌(non-small-cell lung ancer, NSCLC)，其中SCLC占據(jù)肺癌的15%～20%，與NSCLC比較，SCLC的侵襲性更強(qiáng)、早期轉(zhuǎn)移率更高、預(yù)后效果更差[1]。SCLC對(duì)化療較為敏感，第一療程治療后癥狀通常能得到改善，但很快會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥性，導(dǎo)致其預(yù)后依然欠佳，中位總生存期不足6個(gè)月[2]。因此，探究增強(qiáng)SCLC對(duì)化療藥物的敏感度具有重要意義。隨著科技的發(fā)展，多種細(xì)胞死亡形式被逐漸發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞壞死(necrocytosis)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、細(xì)胞自噬(autophagy)以及細(xì)胞焦亡(pyroptosis)等。其中，細(xì)胞焦亡是一種介于凋亡與壞死之間的死亡方式，發(fā)生速度快，可誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)。Gasdermin蛋白E(gasdermin E, GSDME)是細(xì)胞焦亡的最終執(zhí)行蛋白，同時(shí)其剪切活化也是焦亡發(fā)生的標(biāo)志[3]。由于GSDME可介導(dǎo)化療藥物引起的組織損傷，腫瘤中GSDME的表達(dá)量較高，此腫瘤可能對(duì)化療藥物更為敏感[4]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種有絲分裂抑制劑，是近年來最有效的廣譜化療藥物之一，治療晚期NSCLC有效率高達(dá)20%～42%[5]。本研究擬探討過表達(dá)GSDME在紫杉醇治療SCLC中的增敏作用及其可能的分子機(jī)制。

材料與方法

1.組織標(biāo)本、細(xì)胞系和主要試劑：人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(H69、H146、H209、H446、H1688、H2227)、人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)、過表達(dá)GSDME的H69細(xì)胞株(H69-GSDMEhight)購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液(×100)購自美國(guó) Gibco公司；p53通路抑制劑(PFT-α)、caspase3抑制劑(Ac-DEVD-CHO, DEVD)購自美國(guó)Selleck公司；GSDME、β-actin多克隆抗體購自上海圣克魯斯生物技術(shù)公司；通用RT-PCR試劑盒、LDH細(xì)胞毒性試劑盒、CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10%小牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)GSDME水平：利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度和純度后，反轉(zhuǎn)成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，程序?yàn)轭A(yù)變性95℃，10min，變性95℃，10s，退火60℃，20s，延伸72℃，30s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析，使用2-ΔΔCt法分析計(jì)算GSDME基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品均重復(fù)3次。引物: GSDME-上游引物:5′-CGTAGAGAGCCAGTCTTCATTT-3′; GSDME-下游引物:5′-GTTCCAGGACCATGAGTAGTTC-3′; GAPDH-上游引物:5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′; GAPDH-下游引物:5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′。

4.Western blot(WB)法檢測(cè)GSDME蛋白表達(dá)：細(xì)胞分組處理后，收集細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白裂解液濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。2%脫脂牛奶封閉；一抗4℃孵育過夜，洗膜后與二抗室溫孵育30min; 洗膜后加ECL顯影液，放入凝膠分析系統(tǒng)中曝光，拍照存儲(chǔ)并用Image J軟件分析計(jì)算各條帶的灰度值，以每組目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示各組蛋白的表達(dá)水平。

5.乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)檢測(cè)：細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。用酶標(biāo)儀測(cè)量A450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的LDH含量。具體步驟按試劑盒說明書操作。

6.CCK-8：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗滌后使用完全培養(yǎng)基重懸，濃度調(diào)至4×104個(gè)細(xì)胞/毫升，以100微升/孔接種于96孔板。培養(yǎng)箱孵育過夜后，分別加入不同濃度的紫杉醇(0、30、60、80、100μmol/L)處理細(xì)胞，每組均有6個(gè)平行孔，藥物作用時(shí)間分為0、4、8、12、16h。在各組實(shí)驗(yàn)終止前4h，加入現(xiàn)配的CCK-8溶液(10微升/孔)，孵育培養(yǎng)4h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度，計(jì)算存活率，繪制曲線。

7.流式細(xì)胞術(shù)：使用不含EDTA胰酶消化并收集細(xì)胞，細(xì)胞篩過濾后進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞密度稀釋調(diào)整為1×106個(gè)/毫升，用0.3ml Buffer緩沖液重懸細(xì)胞于流式。然后加5μl Annexin V-FITC，室溫避光染色30min，再加10μl PI染液，室溫避光染色20min，通過流式細(xì)胞儀儀檢測(cè)細(xì)胞焦亡情況。

結(jié) 果

1.GSDME在SCLC細(xì)胞株中的表達(dá)：在SCLC細(xì)胞系H69、H146、H209、H446、H1688、H2227細(xì)胞中GSDME mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組16HBE細(xì)胞(P<0.01，圖1A)，且在H69細(xì)胞中的表達(dá)量最低(0.37±0.03)。在各細(xì)胞系中，GSDME蛋白表達(dá)水平的表達(dá)也顯著低于對(duì)照組(P<0.01，圖1B)。

圖1 GSDME在SCLC細(xì)胞株中的表達(dá)A.SCLC細(xì)胞株中GSDME mRNA的表達(dá)量;B.SCLC細(xì)胞株中GSDM蛋白的表達(dá)量;與16HBE細(xì)胞比較，*P<0.01

2.過表達(dá)GSDME增強(qiáng)SCLC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感度：與H69細(xì)胞組比較，經(jīng)30、60、80、100μmol/L濃度紫杉醇處理后，H69-GSDMEhight細(xì)胞的生存率均顯著降低(P<0.01，圖2A)；與H69細(xì)胞組比較，經(jīng)紫杉醇作用4、8、12、16h后，H69-GSDMEhight細(xì)胞生存率均顯著降低(P<0.05，圖2B)。與0μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在30、60、80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.01)；與30μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在60、80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.05)；與60μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.01，圖2C)。

圖2 紫杉醇影響SCLC細(xì)胞生存率和GSDME的切割A(yù).紫杉醇處理劑量與細(xì)胞生存率的關(guān)系，與H69組比較，*P<0.01；B.紫杉醇處理時(shí)間與細(xì)胞生存率的關(guān)系，與H69組比較，*P<0.05，**P<0.01；C.紫杉醇誘發(fā)GSDME切割成GSDME-NT的劑量依賴性;與0μmol/L組比較，*P<0.01；與30μmol/L組比較，#P<0.05，##P<0.01；與60μmol/L組比較，ΔP<0.01

3.紫杉醇誘導(dǎo)過表達(dá)GSDME的SCLC細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡：紫杉醇處理(80μmol/L,8h) H69-GSDMEhight細(xì)胞后培養(yǎng)上清中LDH酶活為17.70±1.10U/L，未處理組的LDH酶活力為5.53±0.53U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3A)。紫杉醇誘導(dǎo)H69-GSDMEhight細(xì)胞死亡以焦亡(Annexin-V FITC+/IP+細(xì)胞)為主(圖3B)。

圖3 紫杉醇誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞的死亡方式A.LDH水平檢測(cè)，與未處理組比較，**P<0.01；B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H69-GSDMEhight細(xì)胞的死亡方式

4.阻斷p53或caspase3影響紫杉醇通過GSDME介導(dǎo)SCLC細(xì)胞焦亡：使用caspase3抑制劑(DEVD, 10μmol/L)和p53抑制劑(PFT-α, 10μmol/L)分別對(duì)H69-GSDMEhight細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再經(jīng)過紫杉醇(80μmol/L)處理，觀察各組細(xì)胞焦亡情況。與PTX處理組比較，PTX+DEVD處理組和PTX+PFT-α處理組H69-GSDMEhight細(xì)胞中的GSDME-NT水平均顯著降低(P<0.01，圖4)。

討 論

SCLC是一種起源于支氣管黏膜上皮的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其特點(diǎn)是惡性程度高、侵襲性高、進(jìn)展快、早期出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，廣泛期小細(xì)胞肺癌預(yù)后極差[6]。目前，對(duì)SCLC的治療沒有絕對(duì)有效的方案，因此探究新的治療方法提高生存收益具有重要意義。近年來，細(xì)胞焦亡被證實(shí)是一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，通過caspase家族蛋白切割并激活gasdermin家族蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔和破裂，引起細(xì)胞內(nèi)容物的釋放誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且伴隨強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[7]。已有多項(xiàng)研究報(bào)道GSDME介導(dǎo)了腫瘤患者化療時(shí)的細(xì)胞焦亡[8]。本研究通過檢測(cè)多株SCLC細(xì)胞中的GSDME的表達(dá)量，分析GSDME與SCLC的相關(guān)性。與對(duì)照相比較，SCLC腫瘤細(xì)胞系中DSDME的mRNA水平和蛋白水平均顯著下調(diào)，說明GSDME的表達(dá)與SCLC的發(fā)生、發(fā)展可能存在關(guān)系。

臨床上一線治療對(duì)大多數(shù)SCLC患者均有較好的療效，但是在治療后2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者甚多，尤其是廣泛期患者2年復(fù)發(fā)率接近100%，患者復(fù)發(fā)后的平均生存時(shí)間也極低[9]。因此在患者體能狀態(tài)允許情況下，臨床多推薦建議復(fù)發(fā)者采納二線化療法，以期延長(zhǎng)患者總生存期和無進(jìn)展生存時(shí)間，減少腫瘤負(fù)荷。目前，二線化療方案多是選擇伊立替康、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱中的一種藥物與鉑類聯(lián)合用藥[10]?；熕幬锟赏ㄟ^細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性壞死等一系列調(diào)控細(xì)胞死亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，有研究指出化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡過程由GSDME介導(dǎo)[11]。GSDME蛋白表達(dá)水平在不同腫瘤細(xì)胞中存在差異，其本底表達(dá)水平與化療藥物敏感度有著密切聯(lián)系[12]。GSDME在大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)缺失或發(fā)生突變，有研究顯示上調(diào)GSDME在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)可使其增殖被顯著抑制[13]。因此，本研究探討了紫杉醇在過表達(dá)GSDME的SCLC腫瘤細(xì)胞的作用效果，結(jié)果顯示過表達(dá)GSDME能夠增強(qiáng)SCLC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感度。

細(xì)胞焦亡和凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種形式。與凋亡相反，細(xì)胞焦亡是腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性壞死的主要形式，它是由caspase-3依賴性的GSDME裂解引起的。GSDME蛋白裂解產(chǎn)生的GSDME-NT可在細(xì)胞膜上成孔，電解質(zhì)失去平衡，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞繼發(fā)性壞死/焦亡，因此GSDME-NT也被認(rèn)為細(xì)胞焦亡的標(biāo)志性蛋白[14]。已知化療藥物可以通過激活caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來殺死細(xì)胞，Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物在體外誘導(dǎo)GSDME細(xì)胞凋亡，使其被caspase-3裂解，該機(jī)制被認(rèn)為是在細(xì)胞凋亡后引起繼發(fā)性壞死。GSDME是抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點(diǎn)，協(xié)同p53參與了腫瘤細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)激等[15]。本研究通過caspase-3抑制劑和p53抑制劑分別處理過表達(dá)GSDME的SCLC細(xì)胞，會(huì)顯著降低紫杉醇導(dǎo)致的GSDME活化，即阻斷紫杉醇誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞的焦亡。

綜上所述，GSDME在SCLC中低表達(dá)，體外通過過表達(dá)細(xì)胞中GSDME的表達(dá)，能夠有效增強(qiáng)SCLC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感度，且該過程受p53、caspase-3活化的影響。本研究結(jié)果表明GSDME在SCLC的治療中具有一定的研究?jī)r(jià)值，為深入了解SCLC的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)。