COX-2和NCOA5在甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達及應(yīng)用

李 軍 王宏坤 萬海玉 王 博 鄭繪霞

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)約占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%[1,2]。經(jīng)外科手術(shù)和放射性碘治療后預(yù)后良好，10年生存率超過90%。但仍有部分患者表現(xiàn)出不良預(yù)后，例如疾病復(fù)發(fā)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至死亡。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph node metastasis, LNM)是PTC局部復(fù)發(fā)的主要因素，也是死亡的顯著危險因素，其發(fā)生率為20%～50%，因此早期識別PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯得尤為重要[3～7]。

環(huán)氧合酶-2(COX-2)是一種多效性酶，在惡性腫瘤細胞的癌變過程和對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[8]。核受體輔激活子5(NCOA5)是一種增強雌激素受體轉(zhuǎn)錄活性的獨特輔助激活因子，最近的研究表明，NCOA5缺乏導(dǎo)致了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[9]。但是這些抗體在甲狀腺腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中的研究甚少。

對象與方法

1.一般資料：收集山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院2019年度因PTC進行手術(shù)治療的患者，所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)生重新閱片。納入標準：①術(shù)前行超聲影像學檢查；②術(shù)前未進行放療、化療、內(nèi)分泌等其他治療；③既往無甲狀腺疾病手術(shù)史。排除標準：①排除同時患有其他惡性腫瘤的患者；②排除臨床病例資料不全的患者。最終共篩選出117例(其中頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者65例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者52例)，患者年齡為19～77歲，平均年齡43歲；腫瘤最大直徑為1～22mm；腫瘤分化程度：高分化49例，中分化+低分化68例；侵犯包膜58例，未侵犯包膜59例；采用第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期60例[10]。另選取癌旁組織66例作為對照。收集相應(yīng)患者頸部超聲資料：①是否出現(xiàn)鈣化;②高回聲;③周邊血流是否有異常信號。

2.實驗試劑及方法：所有標本均經(jīng)10%甲醛溶液固定、脫水機脫水、浸蠟，2μm厚石蠟組織連續(xù)切片，免疫組織化學染色采用Envision法。CK19、BRAFV600E、COX-2及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，NCOA5試劑盒購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

3.結(jié)果判讀：COX-2陽性判讀標準：陽性著色定位于細胞膜或細胞質(zhì)，CD31陽性著色定位于細胞膜，NCOA5陽性著色定位于細胞核，BRAFV600E陽性著色定位于細胞質(zhì)，且均呈淡黃色至棕褐色粗顆粒。每張免疫組織化學切片均采用計算陽性細胞表達百分比和陽性細胞顯色程度的方式進行表達結(jié)果評分[11]。(1)陽性細胞百分比的評分標準：<5%計0分，5%～25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，>75%計4分。(2)陽性細胞顯色程度評分標準：不顯色或顯色不清計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，深褐色計3分。(3)陽性結(jié)果判讀：采用Remmele半定量法，陽性細胞百分比和顯色程度的乘積，0～1分計(-)，>1分計(+)。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，正態(tài)分布計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用校正t檢驗，多因素分析采用Logistic回歸分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理關(guān)系:對117例PTC患者一般資料中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理之間的關(guān)系進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，PTC中淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生的部位、腫瘤最大徑比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PTC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與腫瘤的分期、腫瘤的分化程度、腫瘤是否侵犯包膜比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高分期(AJCC分期Ⅲ期+Ⅳ期)、中低分化的腫瘤、腫瘤侵犯包膜均為PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素。在超聲影像學中，頸部淋巴結(jié)周圍出現(xiàn)異常血流信號為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的危險因素，其他指標如淋巴結(jié)中有鈣化灶及高回聲信號均不是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的危險因素(表1、表2)。

表2 PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理之間的關(guān)系

2.免疫組織化學染色結(jié)果與臨床病理特征之間的關(guān)系:(1)NCOA5、COX-2陽性表達與臨床病理特征之間的關(guān)系:在PTC中，NCOA5的免疫組織化學染色結(jié)果為陰性表達(圖1)，其陽性表達率為31.6%(37/117)，顯著低于癌旁組織中的90.9%(60/66)，而COX-2在癌組織中為陽性表達(圖2)，其陽性表達率為73.5%(86/117)，顯著高于癌旁組織中的10.6%(7/66)，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NCOA5和COX-2蛋白的表達情況與腫瘤的分期、分化程度、腫瘤侵犯包膜、頸部淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊是否有異常血流信號差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。(2)CD31血管陽性及BRAFV600E陽性表達與臨床病理特征之間的關(guān)系：在PTC中，BRAFV600E呈現(xiàn)陽性表達(圖3)，其陽性表達率為76.9%(90/117)，顯著高于癌旁組織中的9.1%(6/66)，CD31在癌組織周圍新生血管中表現(xiàn)為血管陽性(圖4)，其表達率為78.6%(92/117)，顯著高于癌旁組織中的12.1%(8/66)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。BRAFV600E蛋白的表達情況及CD31在癌組織周圍新生血管中的表達情況與腫瘤的分期、分化程度、腫瘤侵犯包膜、頸部淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊是否有異常血流信號，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4)。

圖1 NCOA5在甲狀腺癌組織中的表達(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達；B.在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈細胞膜及胞質(zhì)陽性表達

圖2.COX-2在甲狀腺癌組織中的表達(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈細胞膜及胞質(zhì)陽性表達；B.在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達

表3 NCOA5、COX-2蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

圖3 BRAFV600E在甲狀腺癌組織中表達(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈胞質(zhì)陽性表達；B.在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達

圖4 CD31在甲狀腺癌組織腫瘤周圍新生血管中的表達(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，可見大量新生血管內(nèi)皮細胞呈細胞膜陽性表達；B.在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達

表4 CD31、BRAFV600E蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

3.CD31在癌組織中新生血管陽性率與NCOA5、COX-2、BRAFV600E陽性率一致性分析:CD31在癌組織中新生血管的陽性率與COX-2和BRAFV600E的陽性率呈正相關(guān)，與NCOA5的陽性率呈負相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學有意義(P<0.05)。

4.PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多因素Logistics回歸分析:多元Logistics回歸分析模型檢驗(χ2=42.767，P<0.05)，模型有統(tǒng)計學意義且擬合程度較好。從多元Logistics回歸分析結(jié)果來看，頸部淋巴結(jié)超聲影像學中頸部淋巴結(jié)周邊血流信號異常、免疫組織化學染色結(jié)果NCOA5在癌組織陰性表達、COX-2在癌組織陽性表達均為PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。其中，超聲影像學中頸部淋巴結(jié)周邊血流信號異常征象的患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險增加2.484倍；免疫組織化學染色中，COX-2在癌組織中陽性表達的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的2.9倍，NCOA5在癌組織中陰性表達的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的2.583倍(表5)。

表5 PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多因素Logistics回歸分析

討 論

本研究在對PTC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征之間的聯(lián)系中發(fā)現(xiàn)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤的分期、分化程度以及是否侵犯包膜之間密切相關(guān)，然而，本研究中多元Logistics回歸分析表明，這些因素并不是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，可能與收集的樣本量不足有關(guān)。頸部淋巴結(jié)超聲周邊血流異常信號為頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶超聲征象中的獨立危險因素。進一步研究發(fā)現(xiàn)NCOA5蛋白表達在PTC高分期、中低分化、侵犯包膜、頸部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流異常信號中的陽性率低于低分期、高分化、未侵犯包膜、頸部無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流無異常信號中的陽性率；而COX-2蛋白表達在PTC高分期、中低分化、侵犯包膜、頸部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流異常信號中的陽性率高于低分期、高分化、未侵犯包膜、頸部無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流無異常信號中的陽性率，且差異有統(tǒng)計學意義。

有研究表明NCOA5的弱表達能夠增加白細胞介素6的表達并增強肝細胞肝癌的易感性[12]。NCOA5作為一種隨機的腫瘤抑制因子，與鄰近的非癌組織比較，在40%肝細胞肝癌樣本中觀察到NCOA5的表達水平顯著降低，研究表明NCOA5能夠通過下調(diào)P27，激活PI3K/Akt信號通路，促進腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13,14]。因此NCOA5在直腸癌中可能發(fā)揮著促癌作用。同樣地，在骨肉瘤中，NCOA5在癌組織的表達相對正常組織較低[15]。

本研究中NCOA5在癌組織中的陰性表達與腫瘤的臨床分期、分化程度、侵犯包膜頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示該蛋白與臨床病理特征及其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，但其表達降低的機制當前并不明確，需進一步加強相關(guān)研究。因此PTC的診療中，加強對NCOA5蛋白表達情況的研究，針對低表達采取對應(yīng)的處理措施，從而改善患者預(yù)后。

有研究表明COX-2數(shù)量的增加可激活腫瘤的免疫逃逸，在多發(fā)性骨髓瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，此外，研究表明在結(jié)直腸癌中COX-2、PI3K/Akt信號通路與腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)[16,17]。在結(jié)腸癌中IL-13可能調(diào)控COX-2和PI3K/Akt信號通路，影響結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展。COX-2和PI3K/Akt信號通路隨著IL-13表達變化而變化，提示IL-13可能通過上調(diào)COX-2和PI3K/Akt信號通路相關(guān)基因表達從而促進結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移[17,18]。

本研究中COX-2在癌組織的高表達與臨床分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間密切相關(guān)，提示COX-2在促進PTC的進展。多元Logistics回歸分析結(jié)果表明，COX-2在癌組織中的陽性表達、NCOA5在癌組織中的陰性表達及頸部淋巴結(jié)超聲中的血流異常信號為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的獨立危險因素，且Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，CD31在癌組織中新生血管的陽性率與COX-2和BRAFV600E的陽性率之間呈正相關(guān)，與NCOA5的陽性率呈負相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學有意義。PI3K家族是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與調(diào)控多種信號通路[19]。

PI3K/Akt信號通路在人類腫瘤譜中廣泛失調(diào)，PI3K和其下游分子Akt所組成的信號通路不僅調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活，與腫瘤的血管新生過程、侵襲轉(zhuǎn)移行為也密切相關(guān)[20]。因此，可猜測，COX-2、NCOA5在PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能通過微血管的生成來促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，其具體的機制仍有待于進一步研究證實。在后續(xù)的研究中，可以通過分子水平的研究，以及針對COX-2和NCOA5開展分子靶向治療，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體分子機制揭示更多的循證醫(yī)學資料，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這類具有惡性生物學行為的患者提供更多的診療思路。

綜上所述，COX-2的陽性表達和NCOA5的陰性表達模式與PTC的臨床病理特征及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為PTC臨床診療及評估頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。