枸杞多糖在小鼠膿毒癥肝損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制

劉志昌 周海存 余穩(wěn)穩(wěn) 蘭正蒼 吳 彤 張 安 王文安 寧鵬濤 熊詩萌 閻 龍 劉宏斌

膿毒癥是因感染導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而產(chǎn)生免疫抑制的復(fù)雜臨床綜合征，最終產(chǎn)生休克及多器官功能障礙，病死率高。盡管膿毒癥住院病死率在逐年降低，但據(jù)估計每年全球仍存在3000萬起病例和600萬人死于膿毒癥[1，2]。有研究表明膿毒癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損害，膿毒癥后肝功能障礙是多器官功能障礙和膿毒癥死亡的獨立危險因素[3，4]。膿毒癥患者的肝功能障礙是由組織缺氧、炎性介質(zhì)、自由基、細(xì)菌毒素和藥物毒性等因素介導(dǎo)的，減輕肝損傷可降低膿毒癥患者的病死率，而細(xì)胞凋亡(apoptosis)、炎性損傷和氧化應(yīng)激是上述多種機(jī)制單獨或同時作用下的潛在機(jī)制[5]。

枸杞作為傳統(tǒng)中藥之一，在我國已經(jīng)有2300多年的歷史，具有廣泛的藥理學(xué)作用，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)是從中藥枸杞果實提取的生物學(xué)活性化合物。有研究表明，枸杞多糖在多種疾病中可發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎及抗凋亡等功效[6]，但在膿毒癥甚至肝損傷中的作用尚不明確。

本實驗擬采用盲腸穿孔結(jié)扎法(CLP)建立小鼠膿毒癥肝損傷模型，通過給予枸杞多糖預(yù)防干預(yù)，檢測小鼠血清學(xué)指標(biāo)與組織學(xué)變化，觀察枸杞多糖對膿毒癥肝損傷小鼠的保護(hù)作用，并探究了枸杞多糖在膿毒癥處理的肝損傷小鼠中可能介導(dǎo)的機(jī)制。

材料與方法

1.主要材料：實驗動物由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院實驗動物中心提供，枸杞多糖由陜西帕尼爾生物科技有限公司提供，4%多聚甲醛通用型組織固定液由安徽Biosharp科技有限公司提供，AST、ALT檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，ELISA檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，蛋白質(zhì)預(yù)染標(biāo)志物購自上海賽默飛世爾有限公司，ECL發(fā)光液試劑盒購自安徽Biosharp科技有限公司，SDS-PAGE 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，Bcl-2、Cleaved caspase-3購自英國Abcam公司,TRL-4、p65抗體購自武漢Fine Test生物科技有限公司，β-actin購自北京中衫金橋生物科技有限公司，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記抗兔IgG購自北京中衫金橋生物科技有限公司，電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，離心機(jī)購自上海賽默飛世爾有限公司。

2.實驗動物及藥物：健康雄性清潔級BALB/c小鼠(22～25g)分為4組，每組10只，飼養(yǎng)于溫度20～24℃、相對濕度40%～75%中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院實驗動物中心，自由飲水和飲食。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2020KYLL157)。

3.模型制備與分組:小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)將小鼠分為Ⅰ組假手術(shù)(sham)組、Ⅱ組模型(CLP)組、Ⅲ組枸杞多糖(CLP+LBP)組，Ⅳ組枸杞多糖預(yù)處理后假手術(shù)(LBP+sham)組，枸杞多糖劑量按照Wu等[7]的報道采用400mg/(kg·d)，在造模前2周枸杞多糖組及枸杞多糖預(yù)處理后假手術(shù)組按0.2ml/kg給予枸杞多糖灌胃處理，Ⅰ、Ⅱ組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。干預(yù)14天后Ⅰ、Ⅳ組小鼠僅施行開腹暴露盲腸并還納，造模按照Rittirsch等[8]報道的方式采用CLP，實驗前12h禁食不禁水，用0.1ml/10g水合氯醛腹腔注射麻醉后，復(fù)制嚴(yán)重腹腔感染致膿毒癥模型,術(shù)后給予動物液體復(fù)蘇，麻醉蘇醒后放回籠中正常喂養(yǎng)。

4.標(biāo)本采集：造模24h后各組小鼠在無菌條件下麻醉、開腹，采集動物肝臟組織及血清-80℃冰箱保存。另取一份標(biāo)本保存于4%多聚甲醛通用型組織固定液中。

5.觀察指標(biāo)與方法：(1)肝臟指數(shù)的測定：分別于CLP手術(shù)后第24h處死小鼠，每只小鼠的肝臟都被取出并稱重。切除肝臟上多余的組織和筋膜后，測定肝臟指數(shù)。根據(jù)以下方法計算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。(2)檢測血清ALT、AST水平：采集血液試管為無熱原和內(nèi)毒素試管，EDTA抗凝，先靜置15min，以 3000r/min離心 20min，取血清放置于-80℃冰箱保存。采用比色法檢測血清ALT和AST水平,按試劑盒說明書操作。(3)肝組織病理形態(tài)觀察:24h后處死小鼠，取肝標(biāo)本于4%多聚甲醛通用型組織固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后行組織學(xué)檢查。(4)檢測血清 TNF-α、IL-6水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6。(5)Westem blot法檢測：將肝組織勻漿，蛋白提取后使用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量，計算蛋白上樣量10μg。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳進(jìn)行蛋白樣品的分離，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2h，加入Bcl-2、Cleaved caspase-3、TRL-4、p65抗體、β-actin，4℃搖床孵育過夜，使用TBST充分清洗一抗，加入室溫下辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記抗兔IgG孵育2h，TBST清洗3遍，顯影使用ECL化學(xué)試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。使用Image J圖像分析處理軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

結(jié) 果

1.一般情況:Ⅰ、Ⅳ組小鼠麻醉蘇醒后神智清楚，精神飽滿，活動量較之前略減少。Ⅱ組早期蘇醒后呼吸平穩(wěn)，活動量正常；12h后出現(xiàn)煩躁不安，呼吸急促、淺快；24h后小鼠在之前基礎(chǔ)上出現(xiàn)嗜睡、肢體濕冷、寒顫、豎毛、眼角分泌物、活動量減少、呼吸不規(guī)則等表現(xiàn)；解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有膿性或血性腥臭分泌物，盲腸腫脹、缺血壞死，與周圍組織粘連，肝臟充血水腫，包膜緊張，邊緣變鈍，顏色暗紅。Ⅲ組小鼠24h后出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡、嗜睡、活動度少、觸覺遲鈍、豎毛、眼角分泌物等表現(xiàn)較Ⅱ組小鼠明顯減少。

2.LBP對肝臟指數(shù)的影響：CLP手術(shù)處理24h后，Ⅱ組肝臟指數(shù)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。與Ⅱ組比較，CLP手術(shù)前2周經(jīng)過LBP處理的Ⅲ組的肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.01)，Ⅰ、Ⅳ組肝臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 各組肝臟指數(shù)

3.LBP對AST和ALT的影響：與Ⅰ組比較，Ⅱ組血清中 ALT 和 AST明顯升高；LBP 處理后血清中 ALT和 AST 水平較 Ⅱ 組顯著降低(P均<0.05)；Ⅰ、Ⅳ組肝酶變化比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 枸杞多糖對肝酶的影響A.枸杞多糖對血清中ALT水平的影響；B.枸杞多糖對血清中AST水平的影響。與Ⅰ組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ⅱ組比較，#P<0.05,##P<0.01

4.LBP對肝組織病理改變的影響:各處理組小鼠肝臟的組織病理學(xué)表現(xiàn)詳見圖3，從Ⅰ、Ⅳ組獲得的肝臟組織病理學(xué)檢查顯示正常的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Ⅱ組小鼠的肝組織HE染色顯示肝小葉內(nèi)多灶壞死、肝細(xì)胞水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤，表明CLP致肝損傷模型建立成功。與Ⅱ組比較，LBP預(yù)處理的小鼠(Ⅲ組)肝細(xì)胞腫脹壞死面積明顯縮小及炎性反應(yīng)程度明顯減輕。

圖3 各組肝組織病理學(xué)檢測(HE，×200)A.假手術(shù)組；B.CLP模型組；C.枸杞多糖組；D.枸杞多糖預(yù)處理假手術(shù)組

5.LBP對小鼠血清腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的影響:Ⅰ、Ⅳ組促炎性細(xì)胞因子水平無明顯變化(P>0.05)；與Ⅰ組比較，Ⅱ組血清中促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)水平均顯著升高。LBP 處理后血清中促炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6 水平較CLP 組明顯降低(圖4)。

6.枸杞多糖對膿毒癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示，采用CLP 手術(shù)造模后的小鼠抗凋亡Bcl-2蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05)，促凋亡 Cleaved caspase-3蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)，此外，LBP治療的Ⅲ組小鼠血清抗凋亡蛋白水平明顯高于CLP組(P<0.05),促凋亡蛋白 Cleaved caspase-3的表達(dá)顯著低于CLP組(P<0.01，圖5)。

圖5 各組凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量A.Western blot法結(jié)果；B.Bcl-2抗凋亡蛋白的相對表達(dá)結(jié)果；C.Cleaved caspase-3促凋亡蛋白的相對表達(dá)結(jié)果。與Ⅰ組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ⅱ組比較，#P<0.05,##P<0.01

7.LBP在肝損傷小鼠中肝組織中TLR-4、NF-κB的表達(dá):假手術(shù)組與枸杞多糖預(yù)處理后假手術(shù)組間TLR-4、NF-κB等炎癥相關(guān)通路的蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，CLP 組肝組織中TLR-4、NF-κB 表達(dá)水平急劇上升 (P<0.05)；LBP干預(yù)后TLR-4、NF-κB表達(dá)水平較 CLP 組明顯降低 (P<0.05，圖6)。

圖6 各組TLR-4、NF-κB蛋白的相對表達(dá)量A.Western blot法檢測結(jié)果；B.TLR-4蛋白的相對表達(dá)結(jié)果；C.NF-κB p65的相對表達(dá)結(jié)果。與Ⅰ組比較，*P<0.05;與Ⅱ組比較，#P<0.05

討 論

膿毒癥可導(dǎo)致多器官功能障礙，嚴(yán)重威脅到患者生命健康。肝損傷是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥之一，已成為世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。雖然目前臨床上關(guān)于膿毒癥及肝損傷的治療方式多種多樣，但均以改善肝功、抑制促炎性細(xì)胞因子過度分泌和控制凋亡為特征。此外，已有相當(dāng)多的研究證明，促炎性細(xì)胞因子、凋亡、肝功受損將會加重膿毒癥引起的肝損傷[10，11]。因此，以改善肝損傷為靶向可成為治療膿毒癥的一種有潛力的治療方法。本研究通過枸杞多糖預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)抑制了膿毒癥肝損傷小鼠的肝細(xì)胞凋亡，對肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，這可能與TLR-4/NF-κB通路有關(guān)。

CLP建立的動物模型是目前應(yīng)用最多的膿毒癥模型，因為不但是一個多菌種的膿毒癥模型而且與人類膿毒癥的發(fā)展及特點非常相似，被稱作膿毒癥動物模型的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。當(dāng)發(fā)生膿毒癥時，腸黏膜屏障功能受損，大量的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，當(dāng)肝細(xì)胞受到內(nèi)毒素的侵害時，會發(fā)生肝細(xì)胞水腫釋放AST、ALT[13]。因此，AST和ALT一直是評估肝損傷的敏感指標(biāo)[14]。之前Xiao等[15]使用枸杞多糖預(yù)處理后證實，在CCL4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠中可降低AST、ALT的水平并改善肝細(xì)胞損傷。在本研究中給予枸杞多糖預(yù)處理的小鼠血清AST及ALT顯著降低，組織病理學(xué)檢查中肝細(xì)胞腫脹壞死有明顯改善。這與之前的研究一致，表明枸杞多糖對膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷中具有一定的保護(hù)作用。

另外，膿毒癥時大量的內(nèi)毒素激活枯否細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而損傷人體正常的細(xì)胞[16]。Xiong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，促炎性細(xì)胞因子在肝損傷中同樣發(fā)揮重要的作用。在筆者的實驗中，枸杞多糖預(yù)處理可以有效減少TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，從而減輕了小鼠的炎性反應(yīng)。

最新的研究表明，LBP保護(hù)原代海馬神經(jīng)元免受缺血/再灌注損傷的影響，部分是通過抑制細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的[18]。LBP還能在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的肝損傷和乙醇誘導(dǎo)的酒精肝小鼠中抑制肝細(xì)胞的凋亡[19，20]。本研究結(jié)果表明，枸杞多糖治療可以抑制膿毒癥時肝細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡可能是由滲透的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，如TNF-α、NO和活性氧引起的。LBP減少這些促炎性細(xì)胞因子可能與其抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。此外，LBP降低了CLP誘導(dǎo)的肝NF-κB的激活，后者已被證明是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[21]。

研究發(fā)現(xiàn)TLR-4通過觸發(fā)NF-κB依賴的途徑來介導(dǎo)炎性反應(yīng)，而且TLR-4在肝損傷中同樣發(fā)揮十分重要的作用[22，23]。以往研究表明，NF-κB通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子而加重肝損傷[24]。據(jù)報道，枸杞多糖可在LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞模型中通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，控制炎癥[25]。然而，枸杞多糖對膿毒癥小鼠誘導(dǎo)的肝損傷中關(guān)于TLR-4/NF-κB信號通路尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ組比較，經(jīng)過CLP處理的Ⅱ組小鼠肝臟TLR-4、NF-κB蛋白水平升高。枸杞多糖預(yù)處理的Ⅲ組與Ⅱ組比較，降低了NF-κB、TLR-4表達(dá)。TLR-4/NF-κB信號通路表達(dá)的變化趨勢與肝損傷和炎性反應(yīng)的變化趨勢一致。因此，筆者推測枸杞多糖對膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的緩解作用可能是通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路的表達(dá)而實現(xiàn)的。然而，枸杞多糖中何種成分或哪些成分在發(fā)揮著保護(hù)肝臟的治療作用，仍需在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究，并結(jié)合細(xì)胞實驗進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制。

綜上所述，本實驗觀察到枸杞多糖在膿毒癥引起的肝損傷中具有保護(hù)作用，并證明枸杞多糖控制膿毒癥肝損傷中的炎性反應(yīng)、凋亡及TRL-4、NF-κB的表達(dá)。枸杞多糖可能成為改善膿毒癥及肝損傷的一種有潛力的治療藥物。