復(fù)合氣調(diào)包裝對大蒜鱗莖無氧呼吸代謝的影響

周婧琦，許 建，車玉紅，馬文鵬，陶金華

（1. 漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462000；2. 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技分院，新疆 昌吉 831100）

氣調(diào)包裝技術(shù)包括人工氣調(diào)、自發(fā)氣調(diào)包裝和復(fù)合氣調(diào)包裝，是國際上較為先進(jìn)的貯藏保鮮方式之一。目前大蒜的貯藏保鮮主要集中在輻照保鮮和氣調(diào)貯藏兩種方式，雖然氣調(diào)貯藏的效果較好，但筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，自發(fā)氣調(diào)以及不適的氣調(diào)包裝均會加速大蒜腐爛，并致使大蒜喪失原有風(fēng)味，嚴(yán)重影響鱗莖品質(zhì)。丙酮酸是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，參與了無氧呼吸（乙醇發(fā)酵或乳酸發(fā)酵）和三羧酸循環(huán)（TCA）途徑，在低O2和（或）高CO2環(huán)境下，果蔬易產(chǎn)生無氧呼吸，從而加速組織衰老[1-2]。目前氣調(diào)貯藏中糖酵解途徑研究較多的是大棗，研究認(rèn)為CO2濃度是影響該途徑的主要原因[3]。梁小娥等[4]認(rèn)為梨棗的貯藏環(huán)境中CO2濃度不應(yīng)超過5%，超過此濃度會加速鮮棗的“酒化”。然而針對大蒜的這一方面研究，目前尚未見報道。

本文以新疆白皮蒜為試材，研究復(fù)合氣調(diào)貯藏條件下不同體積分?jǐn)?shù)CO2對大蒜鱗莖丙酮酸代謝及相關(guān)酶、乙烯釋放速率、呼吸強(qiáng)度的影響，探究復(fù)合氣調(diào)貯藏對大蒜貯藏性狀與品質(zhì)影響的相關(guān)機(jī)制，以期為大蒜氣調(diào)貯藏技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

供試材料為新疆白皮蒜，該大蒜品種為春播大蒜，待大蒜完全生理成熟后，于9 月采收，采收后自然陰干，選取無損傷、無病蟲害、蒜皮顏色正常，大小均勻的鱗莖。

塑料包裝材料購于新疆風(fēng)彩包裝有限公司，包裝袋材質(zhì)為聚乙烯（PE）復(fù)合雙向拉伸聚丙烯（BOPP），厚度為0.6mm（0.4mm/0.2mm），包裝袋尺寸：25cm×18cm。

丙酮酸、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、氫氧化鈉、2,4-二硝基苯肼、乙醛、氯化鎂等，均為天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；乙磺酸（MES）、焦磷酸硫胺素、還原性輔酶Ⅰ（NADH），均為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-20-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；AL204-IC 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；600 型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；2014 C 型氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)計4 個處理，其中O2體積分?jǐn)?shù)固定為3.5%，CO2體積分?jǐn)?shù)分別為5%、8%、11%、14%，其他以N2補(bǔ)充。充氣包裝時，先使用真空包裝機(jī)在真空度0.09 MPa 條件下排除空氣，并熱封，然后手動分別注入設(shè)計的體積氣體。每個包裝中注入氣體總體積為200 mL，每個袋子中6 個鱗莖，設(shè)置4 次重復(fù)。每30 d取樣1 次，共取5 次樣，4 個處理，共計80 個氣調(diào)包裝袋，480 個鱗莖。

每30 d 取樣1 次，袋內(nèi)氣體不進(jìn)行處理，取樣時選取完整、無病害腐爛的大蒜鱗莖，去掉蒜皮后用液氮急速充分速凍處理，然后將凍樣存放于-30 ℃冰箱中，用于測定各生理指標(biāo)。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 丙酮酸含量

參考曹建康等[5]的方法，采用2,4-二硝基苯肼法測定。丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，該物質(zhì)堿性條件下呈櫻桃紅色，在520 nm 波長處有最大吸收峰。

1.2.2.2 丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（ADH）活性

PDC 活性測定參照曹建康等[5]的方法。酶提取緩沖液為0.1 mol/L、pH 6.5 乙磺酸（含2 mmol·L-1二硫蘇糖醇（DDT）和40 g/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）），PDC反應(yīng)體系由1.5 mL 0.1 mol/L MES、0.2 mL 5 mmol/L 焦磷酸硫胺素、0.2mL50mmol/LMgCl2、100μL 1.6 mmol/L NADH 溶液、0.2 mL 乙醇脫氫酶溶液、0.2 mL 酶提取液、200 μL 50 mmol/L 丙酮酸溶液。加入丙酮酸后立即搖勻，于340 nm 波長處測定吸光度值，每30 s測定1 次，共測定8 次。

ADH 活性測定參照曹建康等[5]的方法。ADH 反應(yīng)體系為：2.0 mL 0.1 mol·L-1、pH 6.5 MES 緩沖液、100 μL 1.6 mmol·L-1NADH 溶液、0.2 mL 酶提取液、200 μL 80 mmol·L-1乙醛溶液。加入乙醛后立即搖勻，于340 nm 波長處測定吸光度值，每30 s 測定1 次，共測定8 次。

以每分鐘每克鮮品酶促反應(yīng)吸光度值減小0.01為1 個酶活性單位，PDC 或ADH 的活性單位為：0.01△OD340·min-1·g-1，記為U。

1.2.2.3 乙烯釋放速率

參照曹建康等[5]的方法，采用氣相色譜儀測定。

氣相色譜儀：島津2014 C 型，色譜條件：Porapak 80-100，2 mm×2 m，不銹鋼填充柱，F(xiàn)ID 檢測器。載氣（N2）流速50 mL/min，燃?xì)猓℉2）流速50 mL/min，助燃?xì)怏w（空氣）流速100 mL/min。進(jìn)樣溫度120 ℃，柱溫60 ℃，檢測溫度150 ℃。

采用外標(biāo)法定量：將150 g 左右大蒜鱗莖置于1 L容器后密閉靜置4 h，將注射器內(nèi)空氣徹底排凈，由頂部將針頭插入密閉容器內(nèi)，將注射器針桿反復(fù)多次推拉后再取氣體，抽取氣體1 mL，使用氣相色譜儀進(jìn)行測定，每個樣品取3 針氣樣。

1.2.2.4 呼吸強(qiáng)度

參照曹建康等[5]和東惠茹[6]的方法使用氣相色譜儀測定。

氣相色譜儀：島津2014 C 型，色譜條件：Porapak 80-100，2 mm×2 m，不銹鋼填充柱，F(xiàn)ID 檢測器。載氣（N2）流速20 mL/min，橋電流為90 mA。進(jìn)樣溫度120 ℃，柱溫60 ℃，檢測溫度120 ℃。

采用外標(biāo)法定量：具體操作方法同“1.2.2.3”。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS7.05 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，方差分析采用LSD 進(jìn)行最小顯著性差異（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮酸代謝及相關(guān)酶活性變化

2.1.1 丙酮酸含量

由圖1 可見，在氣調(diào)貯藏過程中，大蒜鱗芽中丙酮酸含量整體呈持續(xù)下降趨勢，總體在0～60 d 內(nèi)為快速下降階段，60～120 d 為平緩階段，120～150 d 為二次快速下降階段。貯藏30 d 時，以5% CO2處理組降幅最大，由67.55 mg/100 g 降至44.05 mg/100 g；以8% CO2處理組降幅最小，降至59.13 mg/100 g。貯藏至60 d 時，丙酮酸含量急速降低，CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時變化量高達(dá)34.73 mg/100 g，降幅達(dá)到58.73%。貯藏60～120 d 期間，5% CO2處理組丙酮酸含量持續(xù)下降，其他各處理均有一定幅度增加，增加幅度分別為35.78%、23.88%、45.13%。貯藏至120 d，大蒜鱗莖中丙酮酸含量快速下降，至150 d 時5% CO2、8% CO2、11% CO2和14% CO2組丙酮酸含量分別為11.70 mg/100 g、15.19 mg/100 g、16.14 mg/100 g和16.52 mg/100 g。

圖1 復(fù)合氣調(diào)包裝對貯藏期間大蒜鱗莖丙酮酸含量的影響Fig.1 Effects of composite modified atmosphere packaging on pyruvic acid contents of garlic bulbs during storage

2.1.2 丙酮酸脫羧酶活性

低氧和（或）高二氧化碳環(huán)境有利于保持果蔬的品質(zhì)，延長貯藏時間，但不適宜的氣體條件則會導(dǎo)致果實傷害，低氧脅迫條件下，丙酮酸代謝途徑是重要的環(huán)節(jié)，其中丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶是該代謝途徑中的關(guān)鍵酶[7]。由圖2 可見，氣調(diào)貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長，PDC 活性呈持續(xù)上升趨勢，總體來看，相同貯藏時間，CO2體積分?jǐn)?shù)越高，該酶活性越高。貯藏30 d 時，5% CO2和8% CO2處理組的PDC 活性較低，分別為17.13U 和16.67 U，二者間差異不顯著；14% CO2處理組的PDC 活性最高，為30.18 U。隨著貯藏時間的延長，11% CO2和14% CO2處理組PDC活性均快速升高，至120 d 時分別升至56.25、61.93 U，150 d 時升幅有所下降，分別達(dá)到59.39、67.31 U。

圖2 復(fù)合氣調(diào)包裝對貯藏期間大蒜鱗莖丙酮酸脫羧酶活性的影響Fig.2 Effects of composite modified atmosphere packaging on PDC activities of garlic bulbs during storage

2.1.3 乙醇脫氫酶活性

由圖3 可見，ADH 活性變化規(guī)律整體上與PDC相似，隨著貯藏時間的延長，各處理ADH 活性呈持續(xù)上升趨勢，CO2體積分?jǐn)?shù)越高，則ADH 活性越高，說明提高貯藏環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)將誘導(dǎo)該酶活性的升高。整體來看，5% CO2與8% CO2處理組的ADH活性處于較低水平，與同一貯藏時間的11% CO2和14% CO2處理組間呈顯著差異（P＜0.05）。貯藏60 d時，5% CO2與8% CO2處理組ADH 活性分別為6.47、5.61 U，11% CO2和14% CO2處理組的酶活分別為10.54、13.68 U。貯藏150 d 時，各處理組間差異加大，5% CO2、8% CO2處理組的ADH 活性分別為12.33、14.90 U，11% CO2、14% CO2處理組的ADH 活性分別為26.11、35.26 U。

圖3 復(fù)合氣調(diào)包裝對貯藏期間大蒜鱗莖乙醇脫氫酶活性的影響Fig.3 Effects of composite modified atmosphere packaging on ADH activities of garlic bulbs during storage

2.2 乙烯釋放速率

由圖4 可見，氣調(diào)貯藏過程中大蒜鱗莖的乙烯釋放速率整體呈上升趨勢，5% CO2處理組在貯藏期90 d 時出現(xiàn)乙烯釋放高峰，其他處理組則表現(xiàn)為持續(xù)上升。貯藏60 d 內(nèi)，各處理組大蒜鱗莖的乙烯釋放速率變化較為平緩，介于9.52～29.31 μL·kg-1·h-1，整體變化幅度較小。貯藏90 d 時，8% CO2處理組升高幅度平緩，其他處理組均有顯著升高，且以5% CO2處理組變化幅度最大，由22.33 μL·kg-1·h-1增至74.23 μL·kg-1·h-1。5% CO2處理組在90 d 時達(dá)到乙烯釋放高峰，之后呈快速下降趨勢；而其他處理組則呈持續(xù)上升趨勢，以8% CO2處理組較低。貯藏至150 d 時，14% CO2處理組大蒜鱗莖的乙烯釋放速率為88.82 μL·kg-1·h-1，11% CO2處 理組 數(shù) 值達(dá) 到83.79 μL·kg-1·h-1，處于較高水平，且尚未出現(xiàn)乙烯釋放高峰；此時5% CO2處理組最低，為33.56 μL·kg-1·h-1。

圖4 復(fù)合氣調(diào)包裝對貯藏期間大蒜鱗莖乙烯釋放速率的影響Fig.4 Effects of composite modified atmosphere packaging on ethylene release rates of garlic bulbs during storage

2.3 呼吸強(qiáng)度

由圖5 可見，整個貯藏期間，大蒜鱗莖的呼吸強(qiáng)度整體呈上升趨勢。貯藏60 d 內(nèi)，大蒜鱗莖的呼吸強(qiáng)度變化較為平緩，鱗芽活動體征較弱；當(dāng)貯藏時間達(dá)到90 d 后，其呼吸強(qiáng)度快速升高，以CO2體積分?jǐn)?shù)為11%和14%時的升高幅度最大。大蒜鱗莖的初始呼吸強(qiáng)度為20.03 mg·kg-1·h-1，貯藏30 d 時各處理呼吸強(qiáng)度略有上升，整體介于21.93～25.16 mg·kg-1·h-1，可見上升幅度很小。貯藏120 d 時，各處理均有大幅上升，以11% CO2處理組和14% CO2處理組變化幅度較大，由90 d 時的30.55、14.55 mg·kg-1·h-1分別上升至80.19、82.23 mg·kg-1·h-1，變化幅度分別為162.49%和465.15%，變化極顯著（P＜0.01）。貯藏至150 d 時，5% CO2處理組呼吸強(qiáng)度有所下降，其他處理組均持續(xù)上升，以14% CO2處理組呼吸強(qiáng)度最高，為110.56 mg·kg-1·h-1。

圖5 復(fù)合氣調(diào)包裝對貯藏期間大蒜鱗莖呼吸強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of composite modified atmosphere packaging on respiratory intensity of garlic bulbs during storage

3 討論

大蒜采后衰老與呼吸作用密切相關(guān)，機(jī)體作為“活體”所需的能量通過呼吸作用來提供。保持園藝作物采后品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)之一就是抑制呼吸生理變化，氣調(diào)貯藏通過調(diào)節(jié)貯藏環(huán)境中的O2和CO2配比來抑制呼吸作用，從而降低生理消耗，達(dá)到貯藏保鮮的目的[8-9]。低氧/高二氧化碳環(huán)境能夠較好地保持貯藏品質(zhì)，但園藝作物對二氧化碳和低氧的敏感度不同，易于造成脅迫傷害而加快品質(zhì)劣變，目前針對大蒜鱗莖氣調(diào)貯藏的氣體參數(shù)研究相對較少[10-12]。

丙酮酸是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，且參與了無氧呼吸（乙醇發(fā)酵或乳酸發(fā)酵）和三羧酸循環(huán)（TCA）途徑。本研究中的氣調(diào)貯藏條件下，大蒜鱗莖中的丙酮酸含量呈持續(xù)下降趨勢，而各貯藏階段中丙酮酸變化趨勢各異。這與孫麗娜等[13]和李紅衛(wèi)[3]研究的冬棗中丙酮酸變化規(guī)律不同，認(rèn)為丙酮酸含量累積趨勢是前期升高而后期下降。究其原因，與大蒜的丙酮酸代謝合成路徑有關(guān)，大蒜中的蒜氨酸在蒜氨酸酶作用下能夠合成大蒜辣素，并形成2 分子丙酮酸。由于蒜氨酸與蒜氨酸酶處于細(xì)胞的不同位置，在貯藏過程中細(xì)胞膜的損傷促進(jìn)了底物與酶的結(jié)合，是丙酮酸合成的一大重要途徑。

由丙酮酸代謝可知，丙酮酸代謝受丙酮酸脫羧酶、乳酸脫氫酶（LDH）以及乙醇脫氫酶的影響，前人研究認(rèn)為在O2體積分?jǐn)?shù)減少的情況下，果蔬仍可維持正常的呼吸作用。O2極端不足時便可誘發(fā)無氧呼吸。一般無氧呼吸消失的O2閾值濃度為1%～5%，且與果蔬的品種有關(guān)[14-15]。低氧環(huán)境中的果蔬能量來源于糖酵解途徑，此途徑包含丙酮酸代謝，誘導(dǎo)產(chǎn)生參與無氧呼吸的酶[2]，包括PDC、ADH[16]和LDH[17]等，這些酶在防止毒害物質(zhì)（乙醛、乙醇等）累積方面起到了重要的作用。孫志文等[18]研究了氣調(diào)包裝對西蘭花無氧呼吸作用的影響，認(rèn)為CO2體積分?jǐn)?shù)過高會造成乙醇和乙醛的累積。王亮等[19]研究西蘭花氣調(diào)貯藏條件下丙酮酸脫氫酶（PDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性均呈先升高后降低趨勢，CO2體積分?jǐn)?shù)升高能夠延緩峰值的出現(xiàn)時間。本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有所不同，在貯藏150 d 內(nèi)，大蒜鱗莖的PDC、ADH 活性均呈上升趨勢，且CO2體積分?jǐn)?shù)越高，這兩個酶的活性越高。

丙酮酸含量的變化是無氧呼吸糖酵解途徑和大蒜辣素合成途徑相互影響的結(jié)果。試驗結(jié)果表明，在貯藏期60 d 內(nèi)丙酮酸含量急速下降，說明此階段主要以丙酮酸降解為主，為無氧呼吸提供能量；貯藏60～120 d 屬于平衡階段，該時期丙酮酸代謝與合成處于相對動態(tài)平衡，而隨著貯藏時間的延長，無氧呼吸加劇，糖酵解途徑占主要作用，丙酮酸被快速降解。

乙烯釋放速率與呼吸強(qiáng)度是衡量園藝作物貯藏生理的兩個重要指標(biāo)[20-21]。本試驗結(jié)果可知，在大蒜貯藏過程中，這兩個指標(biāo)的變化規(guī)律相似，由此推測兩指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性。5% CO2處理組乙烯釋放速率在90 d 達(dá)到呼吸高峰，呼吸強(qiáng)度在120 d 時最高，其他處理均呈持續(xù)上升趨勢，且以8% CO2處理組最低。說明在CO2體積分?jǐn)?shù)高于8%時將促進(jìn)大蒜鱗芽的乙烯釋放和呼吸作用，進(jìn)而加速衰老。

4 結(jié)論

上述試驗結(jié)果表明，大蒜低溫（4 ℃）氣調(diào)貯藏過程中，隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的升高，PDC、ADH 活性持續(xù)升高，丙酮酸含量呈下降趨勢；乙烯釋放速率與呼吸強(qiáng)度的變化趨勢相似，低體積分?jǐn)?shù)CO2貯藏條件下均先出現(xiàn)峰值，高體積分?jǐn)?shù)CO2條件下促進(jìn)乙烯釋放速率與呼吸強(qiáng)度持續(xù)增大。綜合各指標(biāo)情況認(rèn)為，大蒜鱗莖在低溫（4 ℃）氣調(diào)貯藏O2體積分?jǐn)?shù)3.5%時，以CO2體積分?jǐn)?shù)不高于8%為理想配比。該條件能夠有效減緩膜脂過氧化程度，降低丙酮酸代謝相關(guān)酶活性，減少有害物質(zhì)累積，同時抑制乙烯釋放速率和呼吸強(qiáng)度。