PACT的抗菌作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展

喬宏偉，房 巖(綜述)，方子源，趙占娟(審校)

(1.河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，河北 保定 071002；2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)用物理學(xué)教研室，河北 保定 071002)

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明，2017年全球由醫(yī)院獲得性感染(hospital acquired infection,HAI)造成的死亡人數(shù)約100萬人，每100例住院患者中，就有7例發(fā)達(dá)國家患者和10例發(fā)展中國家患者獲得HAI。耐藥菌是HAI中常見的感染菌，一些耐藥突變菌株如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和艱難梭菌變異迅速，通過醫(yī)院設(shè)施和個人護(hù)理用品快速傳播，感染形勢嚴(yán)峻，對人類生命健康產(chǎn)生威脅。因此，開發(fā)不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌方法和抗菌藥物已成為一個重要研究方向。光動力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)作為最具前景的一種新型抗菌方法，具有高選擇性、廣譜抗菌性、不良反應(yīng)低以及對病原微生物不易引起耐藥等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)將重點(diǎn)討論P(yáng)ACT的抗菌機(jī)制及新型光敏劑的研究進(jìn)展。

1 PACT概述

20世紀(jì)初，Raab發(fā)現(xiàn)在陽光和光敏染料吖啶紅的作用下，微生物草履蟲會被殺死，并推測該現(xiàn)象是陽光將能量傳遞給化學(xué)物質(zhì)的作用結(jié)果，隨后Tappeiner發(fā)現(xiàn)光誘發(fā)強(qiáng)烈的敏化反應(yīng)時必須有分子氧的存在，并把有分子氧參與的這種光敏化反應(yīng)稱為光動力作用(photodynamic therapy,PDT)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)PDT的作用效果與光敏劑的理化性質(zhì)密切相關(guān)，如果設(shè)計(jì)出一種能夠只與微生物細(xì)胞選擇性結(jié)合的新型光敏劑，光動力就可以實(shí)現(xiàn)抗菌作用，即PACT作用。Jodlbauer和Huber分別在1904年和1905年成功描述光動力滅活細(xì)菌。但早期PDT多用于治療癌癥，即全身靜脈注射或局部使用光敏劑，避光一段時間后，再行激光照射殺滅腫瘤細(xì)胞。用于治療細(xì)菌性疾病的抗生素是在20世紀(jì)中葉發(fā)現(xiàn)的，但在1940年發(fā)現(xiàn)青霉素不久，便出現(xiàn)許多治療失敗的案例并分離出一些對青霉素不再敏感的細(xì)菌菌株，這標(biāo)志著抗生素耐藥性時代的開始。如果不采取任何措施阻止多重耐藥細(xì)菌的增長，預(yù)計(jì)到2050年將有3億人過早死亡，將使世界經(jīng)濟(jì)損失100萬億美元[1]。

PACT對耐藥微生物有很好的殺滅作用，迄今為止，尚未有明顯的證據(jù)表明PACT會在微生物中產(chǎn)生耐藥性，Giuliani等[2]發(fā)現(xiàn)即使經(jīng)過20次連續(xù)的局部殺傷，PACT仍能發(fā)揮很好的作用。PACT的另一個優(yōu)點(diǎn)是光敏劑可局部應(yīng)用于感染區(qū)域。許多慢性感染具有生物膜狀態(tài)細(xì)菌的聚積現(xiàn)象，抗生素不易滲透到生物膜中，而PACT卻能殺死生物膜狀態(tài)的細(xì)胞。因此，PACT作為一種無耐藥性、毒副作用小、作用效果顯著的潛在臨床抗微生物療法得到國際社會的廣泛關(guān)注。

2 光敏劑的研究進(jìn)展

由于PACT的作用效果與光敏劑(photosensitizer，PS)的理化性質(zhì)密切相關(guān)，因此開發(fā)光毒性低、代謝時間短、活性氧物種(reactiveoxygenspecies,ROS)量子產(chǎn)率高、具有明顯陽離子電荷的PS成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。納米尺度的光敏劑與普通光敏劑相比，不但水溶性好，而且還可以產(chǎn)生更多的ROS，進(jìn)而具有良好的滅菌效果?，F(xiàn)總結(jié)近幾年有關(guān)新型光敏劑研究的最新進(jìn)展。

2.1富勒烯及其衍生物 富勒烯是一種封閉的足球狀碳同素異形體，富勒烯具有高度共軛的雙鍵，對可見光有很好的吸收，具有較高的三重態(tài)量子產(chǎn)率，但它們的聚集傾向和高度疏水性，使得其作為藥物在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景不大，所以改善富勒烯的水溶性研究很有意義。目前為克服富勒烯的這些缺點(diǎn)，已經(jīng)有許多用于富勒烯增溶和藥物遞送的方法，包括樹狀聚合物，膠束，PEG化等。Tegos等[3]設(shè)計(jì)三種聚陽離子富勒烯衍生物和三種聚陰離子富勒烯衍生物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行滅活，其中三種聚陽離子富勒烯衍生物顯示出極強(qiáng)的PACT作用，無論施加何種光，金黃色葡萄球菌的殺滅率均高達(dá)99.999 9%。體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)局部感染動物實(shí)驗(yàn)證明聚陽離子富勒烯衍生物具有高效抗菌特性。Yu等[4]將富勒烯衍生物的聚陽離子與熒光素以共價鍵聯(lián)合，由于改變了其分子結(jié)構(gòu)，增加了溶水性的氨基，從而提高了在水中的溶解度，并且證明了靜電荷對水溶液中富勒烯-熒光素結(jié)構(gòu)的構(gòu)象及其光物理性質(zhì)和光化學(xué)活性的重大影響。聚陽離子富勒烯衍生物-熒光素共軛物由于從熒光素到富勒烯的能量(電子)的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光猝滅效應(yīng)，使其活化產(chǎn)生的活性氧效率是單個熒光素或未修飾富勒烯的15倍以上。改良后的富勒烯作為新型抗菌光敏劑具有很強(qiáng)的光穩(wěn)定性，能夠產(chǎn)生高毒性的羥基自由基等，但也具有波長相對較短，不能很好地穿透組織等缺點(diǎn)，若將其應(yīng)用于局部感染區(qū)域則會達(dá)到良好的抗菌效果。

2.2石墨烯及其衍生物 石墨烯是一種二維材料且?guī)稙榱?，石墨烯及其衍生物的抗菌研究前景廣闊。Xia等[5]研究了等離子體Ag/AgX(X=Cl,Br,I)復(fù)合材料鏈接石墨烯薄片在可見光照射下的細(xì)菌滅活機(jī)制，研究顯示該復(fù)合材料的抗菌失活率明顯提高，其抑菌性能主要是由于消毒液中H2O2等活性氧的形成和銀離子的殺菌性能，石墨烯薄片通過提供必要的電荷分離來延遲復(fù)合速率。Khadgi等[6]報(bào)道了ZnFe2O4與Ag和rGO(還原氧化石墨烯)共修飾形成新型復(fù)合材料，在可見光照射下，大腸桿菌菌株在60 min內(nèi)失活，失活率達(dá)7log以上，SEM圖像也顯示了破壞后的細(xì)菌殘骸，活性氧清除實(shí)驗(yàn)確定失活過程的主要活性氧種類為H2O2。Rtimi等[7]也證明具有明顯活性的磷酸鐵聚乙烯透明薄膜額可用于細(xì)菌滅活；研究表明，在陽光照射下，透明的薄膜會變成超親水性，從而使細(xì)菌完全礦化的時間從60 min縮短到30 min。

2.3二氧化鈦及其衍生物 TiO2是一種半導(dǎo)體，它具有毒性小、光吸收強(qiáng)、成本低、化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。Ouyang等[8]制備了C70與TiO2復(fù)合材料，研究了其在可見光照射下的殺菌活性。由于羥基自由基的大量產(chǎn)生，使其殺滅大腸桿菌的消毒率是未修飾TiO2的2倍以上。Koli等[9]發(fā)現(xiàn)在可見光照射下，TiO2/MWCNT復(fù)合材料由于MWCNT的有效電荷分離，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果更強(qiáng)。Liu等[10]研究了在可見光照射下TiO2/Ag3PO4復(fù)合材料對禾谷鐮刀菌的殺菌效果。由于制備的復(fù)合材料引入了有效的電荷分離，提高了可見光的吸收性能，在照射后100 min內(nèi)，真菌被有效地滅活。Rtimi等[11]研究了銅修飾TiO2-ZrO2的光催化殺菌效果。由于帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁上的磷酸根和巰基與銅(強(qiáng)電子供體)有很強(qiáng)的親和力，抗菌性能突出，使其即使在極低的銅含量下，銅修飾復(fù)合材料的失活能力也比未修飾的TiO2-ZrO2高出3倍。

2.4鉍基及其衍生物 鉍基復(fù)合材料是近幾年研究人員偶然發(fā)現(xiàn)的新化合物，具有明顯的窄帶隙，因此與傳統(tǒng)的光催化劑如TiO2和ZnO相比，其可見光吸收能力更好。Wang等[12]制備了一種新型可見光活性光催化劑單斜二異硫四氧化物，研究其殺菌活性，發(fā)現(xiàn)在可見光照射下120 min內(nèi)，細(xì)菌被完全滅活。Adn等[13]研究了不同Er3+和Y3+摻雜量的BiVO4樣品對細(xì)菌的滅活效果，發(fā)現(xiàn)所有鉍樣品在紫外光和可見光照射下均表現(xiàn)出3log的失活。

2.5其他新型抗菌劑PS 許多實(shí)驗(yàn)室嘗試引入具有更高活性的化合物，或者是天然存在的染料[14]。例如，陽離子鋅酞菁RLP068、陽離子苯丙烯酮衍生物SAPYR和卟啉Sylsens B具有較高抗菌活性；從天然產(chǎn)物中衍生出的高效化合物，例如：從圣約翰麥汁(St John's Wort)中衍生出的陽離子金絲桃素化合物、從維生素B2衍生出的陽離子核黃素化合物以及姜黃素(姜黃中發(fā)現(xiàn)的黃色香料)的陽離子衍生物SACUR-3等均具有很好的抗菌效果。

3 無機(jī)鹽增強(qiáng)PACT作用的研究進(jìn)展

Kasimova等[15]發(fā)現(xiàn)在噻嗪染料中添加疊氮化鈉可增強(qiáng)革蘭陽性和陰性細(xì)菌的PACT作用，他認(rèn)為這歸因于電子從疊氮化物陰離子轉(zhuǎn)移到PS三重態(tài)，產(chǎn)生疊氮基自由基，進(jìn)而PACT作用得到增強(qiáng)。Yin等[16]發(fā)現(xiàn)添加疊氮化物陰離子，富勒烯衍生物介導(dǎo)的PACT作用同樣得到加強(qiáng)。疊氮離子的增強(qiáng)表現(xiàn)為通過電子轉(zhuǎn)移機(jī)制產(chǎn)生成疊氮基自由基。需要注意的是，理論上疊氮化物增強(qiáng)微生物的光殺滅作用可行，但其毒性卻阻礙了臨床應(yīng)用。

Vecchio等[17]通過在體外和體內(nèi)添加碘化鉀，亞甲基藍(lán)介導(dǎo)的PACT作用持續(xù)增強(qiáng)。在體內(nèi)還觀察到在治療后的幾天中傷口細(xì)菌復(fù)發(fā)的較少，并推測作用機(jī)理可能是由于反應(yīng)性碘物質(zhì)的形成，這些碘物質(zhì)的生成時間短，壽命短。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)，通過添加碘化物的增強(qiáng)作用也適用于由聚陽離子富勒烯衍生物介導(dǎo)的PACT。另外還有研究表明，吩噻嗪類染料和陽離子富勒烯都不能通過添加溴化物陰離子來增強(qiáng)微生物殺滅作用；然而，由UVA激發(fā)的二氧化鈦納米顆粒(大的帶隙半導(dǎo)體)卻可以通過添加溴化物來增強(qiáng)光活性抗菌，這種增強(qiáng)是通過次溴酸鹽中間產(chǎn)物的產(chǎn)生而增強(qiáng)的[19]。

4 PACT作用機(jī)制的研究進(jìn)展

PACT作用于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多個分子靶標(biāo)，具有非選擇性作用。PACT的這些氧化目標(biāo)主要取決于PS的各自細(xì)胞定位以及新出現(xiàn)的ROS的最大時限擴(kuò)散長度。光敏劑的細(xì)胞定位與光敏劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如分子大小、電荷、親脂性)、濃度、溶劑以及細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如，1O2只有3～4 ms的短壽命，所以1O2的擴(kuò)散長度不超過0.3 mm，并取決于周圍的介質(zhì)。目前，對于PACT的作用機(jī)制尚不完全清楚，眾說紛紜，大致可分為以下幾類。

4.1PACT破壞生物膜系統(tǒng) 微生物生物膜是由自產(chǎn)聚合物基質(zhì)包圍的微生物細(xì)胞的集合，存在單物種和多物種生物膜，生物膜可附著在宿主的表面，也可不附著在宿主的表面，它們主要位于宿主組織或分泌物中。據(jù)研究表明由生物膜引起的感染約占人類所有細(xì)菌和真菌感染的80%[20]。Zarnowski等[21]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌耐藥性與生物膜形成有關(guān)，Chandra等[22]推測其耐藥機(jī)制主要與藥物外排泵和細(xì)胞膜甾醇的變化有關(guān)。Luke-Marshall等[23]發(fā)現(xiàn)在二氫卟吩e6的介導(dǎo)下，PACT對浮游培養(yǎng)物和卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的生物膜都具有顯著的殺菌活性。Li等[24]在亞甲基藍(lán)和孟加拉玫瑰紅的介導(dǎo)下，通過添加碘化鉀在激光共聚焦顯微鏡下觀察PACT對糞腸球菌的殺傷作用，結(jié)果顯示以生物膜形式存在的糞腸球菌被有效清除。Pinto等[25]證明在甲苯胺藍(lán)O的介導(dǎo)下，PACT作用可以抑制白色念珠菌在不同發(fā)育階段產(chǎn)生的生物膜的生存能力，Quishida等[26]得出了相似的結(jié)論，即在姜黃素的介導(dǎo)下，PACT作用可以抑制白色念珠菌、光滑念珠菌和變形鏈球菌在不同發(fā)育階段產(chǎn)生的生物膜的生存能力。

4.2PACT破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 張子平等[27]觀察到5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的PACT作用，使得白念珠菌細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不完整，并推測PACT作用對白念珠菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有一定的影響。林一勤[28]探討了在新亞甲基藍(lán)的介導(dǎo)下，PACT對多重耐藥鮑曼不動桿菌的殺傷作用，結(jié)果顯示新亞甲基藍(lán)的濃度越高，殺傷作用越大，用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被明顯破壞，因此推測PACT的作用機(jī)制是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，來達(dá)到滅菌的目的。任雅清等[29]推測在血啉甲醚的介導(dǎo)下，PACT殺滅大腸桿菌的作用機(jī)制是選擇性的攻擊細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，致使細(xì)胞膜損傷、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞壁上蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而達(dá)到滅菌的效果。

4.3PACT破壞細(xì)菌遺傳物質(zhì) 相關(guān)研究證明PACT可以破壞細(xì)菌的DNA結(jié)構(gòu)。Sudhamani等[30]發(fā)現(xiàn)光敏劑Co(Ⅱ)配合物介導(dǎo)的PACT滅活大腸桿菌的效果良好，并通過電子吸收光譜法發(fā)現(xiàn)Co(Ⅱ)配合物對雙鏈DNA的溝槽結(jié)合傾向，通過凝膠電泳法證明Co(Ⅱ)配合物能誘導(dǎo)DNA裂解。劉漢杰等[31]證明在單核釕(Ⅱ)多吡啶釕配合物介導(dǎo)下，PACT對大腸桿菌的滅活是配合物通過嵌入DNA雙鏈內(nèi)部，造成切割降解作用，以此為基礎(chǔ)，配合物能夠干擾細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄過程，抑制細(xì)菌生長。M?rtensson等[32]同樣證實(shí)了在單核釕(Ⅱ)多吡啶配合物介導(dǎo)下，PACT對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的滅活是配合物與DNA結(jié)合的作用。

4.4PACT破壞細(xì)菌毒力因子 近年來一些研究表明PACT不僅能夠殺滅細(xì)菌，還能使細(xì)菌的毒力因子失活。Tubby等[33]使用665 nm的激光介導(dǎo)亞甲基藍(lán)，可以降低金黃色葡萄球菌的毒力，并能有效地殺滅金黃色葡萄球菌，α-溶血素和鞘磷脂酶的失活不受人血清的影響，表明PACT可能對體內(nèi)的這些毒素有效。PACT還能影響兩種關(guān)鍵的細(xì)菌毒力因子——脂多糖和蛋白酶的效價。Bartolomeu等[34]研究結(jié)果表明，部分外源性毒力因子的表達(dá)受PACT的影響，產(chǎn)腸毒素菌株對PACT的敏感性高于非產(chǎn)腸毒素菌株，且存活的細(xì)菌沒有產(chǎn)生耐藥性；與傳統(tǒng)抗生素相反，PACT抑制了毒力因子的表達(dá)，有效地滅活了高毒力金黃色葡萄球菌菌株和低毒力金黃色葡萄球菌菌株，也滅活了對抗生素敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，并且在至少10個連續(xù)治療周期后不產(chǎn)生耐藥性，因此，這種療法可能成為一種很有前途的來控制病原微生物的抗生素替代品。

5 展 望

綜上所述，盡管PACT滅菌尚未在臨床上推廣應(yīng)用，但大量體外研究顯示，與抗生素相比PACT在抗菌方面有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，即選擇性高，殺菌范圍廣，毒副作用小，極少誘導(dǎo)耐藥性等。隨著對PACT的進(jìn)一步研究，PACT面臨的技術(shù)問題必將得到解決，相信在不久的將來，PACT將應(yīng)用于臨床，成為消滅細(xì)菌感染的主要方法。