桂林市首次在健康人群中檢出１株硫化氫陽(yáng)性甲型副傷寒的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告

劉志冰 郭昕 蔣立立

【摘要】目的：防止漏檢硫化氫陽(yáng)性甲型副傷寒菌株。方法：2019年2月在一食品從業(yè)人員肛拭標(biāo)本中檢出1株甲型副傷寒沙門(mén)菌，用SC增菌液增菌，沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基分離，對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)生化、血清學(xué)試驗(yàn)，RT-PCR技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果：分離培養(yǎng)、生化特性、血清學(xué)試驗(yàn)均符合甲型副傷寒沙門(mén)菌特性，硫化氫陽(yáng)性。經(jīng)微量生化等系統(tǒng)鑒定為1株硫化氫陽(yáng)性的甲型副傷寒菌。結(jié)論：必須注意鑒別硫化氫陽(yáng)性的甲型副傷寒菌。

【關(guān)鍵詞】甲型副傷寒菌;硫化氫陽(yáng)性

基金項(xiàng)目：廣西桂林市科技局項(xiàng)目（NO.20190602-2）

【Abstract】Objective：to prevent the detection of H2S positive paratyphoid strain. Methods：1 strains of Salmonella paratyphi A were detected in a food worker's anal swab in February 2017. The bacteria were increased by SC bacteria， and the Salmonella color culture medium was separated. The biochemical and serological tests of the strains were carried out. The RT-PCR technique was used to confirm the separation and culture， the biochemical characteristics and the serological test. Salmonella paratyphi A is characteristic of hydrogen sulfide. 1 strains of Salmonella paratyphi positive were identified by microbiological system. Conclusion： we should pay attention to distinguishing paratyphoid A from H2S positive.

【Key words】paratyphoid A; hydrogen sulfide positive

?傷寒、副傷寒是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法《 規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，傳染性強(qiáng)、病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)、并發(fā) 癥多、疾病負(fù)擔(dān)重，是發(fā)展中國(guó)家面臨的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。桂林市傷寒、副傷寒發(fā)病率一直在廣西名列前茅，于20世紀(jì)80年代為最高峰，之后開(kāi)始逐漸下降，呈散發(fā)狀態(tài)，并穩(wěn)定在一定水平。

2019年2月，桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科病原微生物室從健康體檢人員肛拭子標(biāo)本中分離到1株產(chǎn)硫化氫的A群沙門(mén)菌，經(jīng)生化檢驗(yàn)，血清凝集，細(xì)菌核酸測(cè)定，鑒定為甲型副傷寒，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源：由桂林市疾病預(yù)防控制中心病源微生物檢驗(yàn)室從食品從業(yè)人員健康體檢的肛拭標(biāo)本中檢出。

1.2 材料 SC增菌液、克氏三糖鐵瓊脂，XLD培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基和沙門(mén)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基均購(gòu)自科瑪嘉生物科技有限公司;沙門(mén)菌診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司和丹麥血清;ID32E生化試驗(yàn)條購(gòu)自上海星佰科技有限公司。BIO-CFX96熒光PCR儀，傷寒，副傷寒沙門(mén)菌檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳生科原生物科技有限公司，上述實(shí)驗(yàn)材料均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法 按照《從業(yè)人員預(yù)防性健康檢查沙門(mén)菌，志賀菌檢驗(yàn)方法》（WS/T458-2014）進(jìn)行試驗(yàn)。

2 標(biāo)本檢測(cè)

2.1 細(xì)菌分離 ?將健康體檢人員肛拭子標(biāo)本接種至SC增菌液中，37℃培養(yǎng)18 h～ 24 h， 劃線分離到沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基以及XLD平板上， 37℃培養(yǎng)18 h～ 24 h后，在沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上挑取表面光滑濕潤(rùn)，紫紅色，中等大小的圓形菌落及XLD平板上挑取圓形邊緣整齊，紅色半透明，表面光滑濕潤(rùn)，中心呈黑色或無(wú)色菌落轉(zhuǎn)種三糖鐵培養(yǎng)基上， 經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h， 三糖鐵管呈現(xiàn)葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 乳糖不分解， 劃線上產(chǎn)生少量H2 S， 動(dòng)力+。同時(shí)，將其轉(zhuǎn)種到血平板上，培養(yǎng)18 h～ 24 h。

2.2 生化鑒定 ? 挑取血平板上菌落調(diào)成0.5麥?zhǔn)袭?dāng)量菌液， 按廠家說(shuō)明書(shū)程序接種于ID32E生化試驗(yàn)條上，37℃24小時(shí)培養(yǎng)后用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果為甲型副傷寒， 鑒定編號(hào)為6704752， 具體結(jié)果如下：

陽(yáng)性結(jié)果：賴(lài)氨酸脫羧酶， 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶， 精氨酸雙水解酶， 葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 檸檬酸鈉， 甘露醇， 硫化氫， 肌醇， 山梨醇， 鼠李糖，阿拉伯糖， 蜜二糖， 硝酸鹽還原。

陰性結(jié)果：氧化酶， ONPG， 尿素， 色氨酸脫氨酶， 吲哚， VP，明膠， 蔗糖， 苦杏仁苷。

2.3 血清學(xué)試驗(yàn)： 待測(cè)菌與沙門(mén)菌屬診斷血清凝集 A - S群O 多價(jià)呈強(qiáng)凝集（ ++++）， 并與O2呈強(qiáng)凝集（+ ++ +）與 O1呈強(qiáng)凝集（+ ++ +）與O12呈強(qiáng)凝集（+ ++ +），與HMA （a， b， c， d， i， z10， z29） 呈強(qiáng)凝集（+ ++ +），與H a呈強(qiáng)凝集（+ ++ +）.H 因子第二相與診斷血清不凝集。用H a誘導(dǎo)血清經(jīng)2次位相誘導(dǎo)后， 仍然不凝集。說(shuō)明H 因子第二相缺失。從而得出其分子型為：2，12：a：- 。根據(jù)《沙門(mén)氏菌屬血清型診斷》中的診斷，符合甲型副傷寒沙門(mén)菌定義。

2. 4 ? 核酸鑒定：為了確保準(zhǔn)確無(wú)誤，我們用熒光PCR法進(jìn)行了甲型副傷寒核酸測(cè)定，結(jié)果為擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，CT值為17.74和18.18。

2.4.1核酸提?。涸谝鸭兓臓I(yíng)養(yǎng)斜面上挑取適量菌苔加入1毫升無(wú)菌生理鹽水中，混勻。取200微升加入到核酸提取試劑板中，放至核酸自動(dòng)提取儀上，按操作說(shuō)明進(jìn)行核酸提取。

2.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) ? 按照生科原甲型副傷寒檢測(cè)試劑盒上說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)體系，其中反應(yīng)條件：95℃ 5 min;95℃ 10 s，55℃ 32 s，72℃ 15 s（共40個(gè)循環(huán)）。在第2個(gè)循環(huán)周期的55℃ 退火階段采集FAM通道的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。 結(jié)果待檢樣本在熒光通道上與甲型副傷寒沙門(mén)菌陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，CT值為17.74和18.18，陽(yáng)性陽(yáng)性對(duì)照CT值為19.74。

3 結(jié)論

根據(jù)上述培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)以及核酸測(cè)定， 該分離菌符合甲型副傷寒沙門(mén)菌定義， 因此該從業(yè)人員確定為甲型副傷寒沙門(mén)菌帶菌者。

4 討論

4.1 甲型副傷寒是一種常見(jiàn)腸道傳染病，可以通過(guò)飲水、食物和日常生活接觸等方式傳播。桂林市地處喀斯特地貌，地下水源豐富，極易引起腸道傳染病的發(fā)生。近年來(lái)隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的提升，作為國(guó)家旅游勝地的桂林市人員流動(dòng)急劇增加，傷寒副傷寒以及非傷寒沙門(mén)菌病例報(bào)告呈上升趨勢(shì)。

4.2 ?非傷寒沙門(mén)菌在桂林市健康人群的檢出率在0.6%--2.5%，但傷寒副傷寒在健康人群中的檢出卻很低，這可能與傷寒副傷寒為胞內(nèi)寄生菌，通常入血，隨血液擴(kuò)散到全身，用病人的血液做血培養(yǎng)檢測(cè)甲型副傷寒沙門(mén)菌比較容易檢出，但癥狀消失后常寄身在膽囊中，用肛拭子檢測(cè)難以檢測(cè)到有關(guān)。而在健康人群的肛拭子中檢出甲型副傷寒，實(shí)屬少見(jiàn)，產(chǎn)H2S株就更為罕見(jiàn)，故具有重大意義。

4.3 甲型副傷寒沙門(mén)菌在通常情況下不產(chǎn)H2S，實(shí)驗(yàn)室工作人員在做產(chǎn)H2S菌株診斷血清凝集時(shí)容易忽略O(shè)2的凝集.當(dāng)其他O因子血清都不凝時(shí)，容易被當(dāng)作雜菌而被棄掉。

4.4 ?由于沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基成本比較高，基層實(shí)驗(yàn)室多選擇使用XLD培養(yǎng)基或SS培養(yǎng)基。大多數(shù)沙門(mén)菌在XLD平板或SS平板上均產(chǎn)H2S而使菌落呈現(xiàn)黑色，在挑取可疑菌落時(shí)容易被發(fā)現(xiàn)。而甲型副傷寒沙門(mén)菌由于不產(chǎn)H2 S而在XLD平板上呈紅色半透明菌落，或者在SS平板上呈無(wú)色透明菌落，與大腸菌相似，及難分辨。同時(shí)在健康體檢人群的肛拭標(biāo)本中，可疑菌落少，雜菌菌落復(fù)雜，在XLD培養(yǎng)基或SS平板上挑取可疑菌落時(shí)不容易被發(fā)現(xiàn)而造成漏檢。

因此提醒從事微生物檢測(cè)的工作人員，在具體檢驗(yàn)過(guò)程中，要本著實(shí)事求是的態(tài)度，在遵循一般規(guī)律的同時(shí)，要考慮特殊菌株的生化特異性，多參考國(guó)內(nèi)外最新資料，不能機(jī)械地、一味地按程序檢驗(yàn)，注重平時(shí)經(jīng)驗(yàn)和規(guī)律的積累，否則易導(dǎo)致漏檢或誤判。

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作者簡(jiǎn)介：劉志冰（1966-），女，廣西富川縣人，主管檢驗(yàn)技師，主要從事病原微生物檢驗(yàn)工作.