動(dòng)態(tài)高壓下大豆分離蛋白/多糖復(fù)合物表征

敬思群，王德萍，周苗苗，縱偉

1.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院（韶關(guān) 512005）；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊 830046）；3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450002）

大豆粕經(jīng)過(guò)低溫脫溶，得到一種新的蛋白類食品添加劑——大豆分離蛋白。大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上，富含人體所需的多種必須氨基酸，營(yíng)養(yǎng)極其豐富[1-2]。大豆分離蛋白在起泡性、乳化性等功能特性方面特點(diǎn)突出，在食品加工生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，成為一種可以替代動(dòng)物蛋白的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[3-4]。但是單一的大豆分離蛋白在成膜的機(jī)械性能和功能特性方面存在著很大的不足，需要通過(guò)適宜的手段進(jìn)行改性。多糖是由多個(gè)單糖分子經(jīng)過(guò)縮合、失水等過(guò)程形成，相對(duì)分子質(zhì)量大，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖按極性可分為三大類，即陰離子多糖（殼聚糖）、陽(yáng)離子多糖（卡拉膠）和中性多糖（葡聚糖）。多糖是高分子化合物，含有大量的極性基團(tuán)，在疏水性、溶解性、黏度、穩(wěn)定性等方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)改性方面和食品生產(chǎn)加工應(yīng)用極其廣泛。動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)（DHPM）是一種較為前沿的高壓技術(shù)，結(jié)合高壓理論、流體力學(xué)理論和撞擊流理論，對(duì)流體物料進(jìn)行強(qiáng)烈的剪切，瞬間壓力，高速的撞擊、高頻的振蕩等一系列聯(lián)合作用，對(duì)待處理物料進(jìn)行均一化、微乳化、超微化等操作[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白（純度90%，食品級(jí)，哈高科大豆食品有限公司）；葡聚糖、卡拉膠、殼聚糖、三（羧甲基）氨基甲烷、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉（均為分析級(jí)）。

FPG128000動(dòng)態(tài)超高壓微射流（英國(guó)SFP公司）；Nano-ZS90激光散射儀（英國(guó)Malern公司）；DYY-7C電泳儀電源（北京六一儀器廠）；JSM-6490LV掃描電鏡（日本JEOL公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Bruker公司）；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Chirascan圓二色光譜儀（英國(guó)應(yīng)用光物理公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Bruker公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量大豆分離蛋白，加入去離子水，配制成質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的母液，用磁力攪拌器攪拌20 min使之充分溶解，使用膠體磨處理，將其細(xì)化及均勻分布，靜置4 ℃環(huán)境下水化過(guò)夜，得到大豆分離蛋白水溶液。

分別稱取適量的葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠，加入去離子水，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的溶液，玻璃棒攪拌使其充分溶解，溶液中加入濃度0.02%的NaN3作為抑菌劑，防止細(xì)菌生長(zhǎng)，靜置4 ℃冰箱水化過(guò)夜，分別得到葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠水溶液。

1.2.2 大豆分離蛋白-多糖動(dòng)態(tài)超高壓復(fù)合物的制備

將提前預(yù)處理好的大豆分離蛋白水溶液和多糖（分別為葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠）水溶液按照2∶1比例進(jìn)行混合，配置成大豆分離蛋白-多糖混合溶液。用玻璃棒攪拌使其混合均勻。采用PHB-3筆式pH計(jì)分別調(diào)節(jié)混合溶液的pH，大豆分離蛋白-葡聚糖混合溶液調(diào)至pH 7，大豆分離蛋白-殼聚糖混合溶液調(diào)節(jié)至pH 2，大豆分離蛋白-卡拉膠混合溶液調(diào)節(jié)至pH 10。采用動(dòng)態(tài)高壓微射流均質(zhì)機(jī)對(duì)3種大豆分離蛋白-多糖混合溶液進(jìn)行處理。均質(zhì)壓力120 MPa，循環(huán)處理2次（實(shí)驗(yàn)室前期研究所得），將處理液離心20 min，離心速度8 000 r/min，收集上清液，將其分成2個(gè)部分，一部分直接進(jìn)行測(cè)定，另一部分樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.2.3 SDS-PAGE分析

參考Mehrajfatema等[8]的方法進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)操作。用考馬斯亮藍(lán)R-250試劑對(duì)凝膠膠片進(jìn)行蛋白質(zhì)染色[9]。

1.2.4 紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)掃描

將大豆分離蛋白、多糖（葡聚糖、殼聚糖、卡拉膠）單物質(zhì)和大豆分離蛋白-多糖超高壓復(fù)合物分別配置成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的溶液，用玻璃棒攪拌，使其充分溶解。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)掃描范圍為190~500 nm，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.5 接枝度的測(cè)定

參照齊寶坤等的方法[10]，采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測(cè)定大豆分離蛋白-多糖動(dòng)態(tài)超高壓復(fù)合物的接枝度。將處理好的待測(cè)樣品于340 nm處測(cè)定其吸光度A。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。樣品接枝度的大小反應(yīng)大豆分離蛋白與多糖接枝聚合的程度，值越大，表明接枝聚合程度越大，反之則越小。接枝度的計(jì)算如式（1）。

式中：A樣為大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物吸光度；C樣為復(fù)合物中大豆分離蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；A白為大豆分離蛋白吸光度；C白為大豆分離蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.6 傅里葉紅外光譜

參考Schestkowa等[11]的方法稍作改動(dòng)。稱取2 mg大豆分離蛋白-多糖動(dòng)態(tài)超高壓復(fù)合物粉末樣品，加入適量干燥的KBr進(jìn)行壓片，將壓片放入測(cè)定室內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。掃描范圍為4 000~400 cm-1，每個(gè)樣品的紅外圖譜為掃面32次的疊加圖。通過(guò)分析復(fù)合物紅外吸收光譜變化，表征大豆分離蛋白與多糖的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.7 內(nèi)置熒光光譜

參考Morales等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。用5 mmol/L磷酸標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 7）配制待測(cè)液（蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL），在激發(fā)波長(zhǎng)334 nm處用熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)掃描（350~500 nm），設(shè)置電壓600 mV，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬5 nm，記錄各樣品的熒光光譜。通過(guò)蛋白質(zhì)溶液熒光強(qiáng)度的大小表征蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合程度，熒光強(qiáng)度越弱，大豆分離蛋白與多糖結(jié)合程度越大，反之則越小。

1.2.8 圓二色光譜

參考Zhang等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。用0.01 mol/L磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 7）溶解一定量的待測(cè)樣品（蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL），設(shè)定掃描波長(zhǎng)190~260 nm，樣品池光程2 mm，分辨率0.5 nm，掃描速度100 nm/min，靈敏度100 mdeg/cm，試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。試驗(yàn)值為3次掃描的平均值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理和分析，采用Origin 8.0和Prism 6.0繪制圖表，每次試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行，取平均值，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺電泳來(lái)分析大豆分離蛋白-多糖超高壓復(fù)合物在形成過(guò)程中亞基的變化及相對(duì)分子質(zhì)量的變化情況。圖中1條帶為大豆分離蛋白，2~4條帶分別為葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠，5~7條帶為大豆分離蛋白-葡聚糖、大豆分離蛋白-殼聚糖和大豆蛋白-卡拉膠復(fù)合物。圖譜結(jié)果表明，大豆分離蛋白條帶是由β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各個(gè)亞基所組成。經(jīng)過(guò)DHPM處理得到的大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物在相對(duì)分子質(zhì)量70~100 kDa的蛋白含量減少，在相對(duì)分子質(zhì)量20~25 kDa出現(xiàn)新的條帶，表明DHPM處理大豆分離蛋白和多糖，使得二者之間相互作用，形成復(fù)合物。

圖1 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物SDS-PAGE圖

2.2 全波長(zhǎng)掃描光譜分析

多肽鏈中的一切原子單鍵的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生空間排布的變化構(gòu)成蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)中氨基酸的微環(huán)境在一定程度上與光譜特征相關(guān)，因此用光譜特征的變化來(lái)反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化情況。由圖2可以看出，單純的大豆分離蛋白在紫外光譜區(qū)域具有2個(gè)特征的蛋白質(zhì)吸收帶，其特征峰的大致位置分別在220 nm和280 nm附近。220 nm處的特征吸收峰主要是大豆分離蛋白肽鍵上的羰基的n-π*電子躍遷所引起；208 nm處的特征吸收峰是大豆分離蛋白分子中色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)π-π*和n-π*電子躍遷所引起。大豆分離蛋白220 nm處吸收峰強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于280 nm處吸收峰強(qiáng)度。隨著多糖加入，2個(gè)特征峰均呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，表現(xiàn)為減色效應(yīng)。220 nm處的吸收光譜減色效應(yīng)更為明顯，表明多糖的引入與蛋白質(zhì)肽鍵上的羰基發(fā)生部分結(jié)合，使得復(fù)合物在220 nm處吸收峰強(qiáng)度減弱；同時(shí)，吸收峰的峰位發(fā)生藍(lán)移（向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)），也說(shuō)明大豆分離蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變。

圖2 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物紫外光譜圖

2.3 接枝度（DG）的測(cè)定

糖基化反應(yīng)是基于美拉德反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的Amadori重排過(guò)程，使蛋白質(zhì)分子中游離氨基基團(tuán)連接到多糖分子的還原端。試驗(yàn)采用接枝度表征體系游離氨基的變化情況，從而表征大豆分離蛋白與多糖在動(dòng)態(tài)高壓微射流的作用下結(jié)合的情況。圖3是大豆分離蛋白分別與葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠經(jīng)過(guò)超高壓處理所形成復(fù)合物溶液的接枝度變化。3種復(fù)合物溶液接枝度與對(duì)照組相比較，顯著性增加（p＜0.01）。這是由于動(dòng)態(tài)高壓微射流的處理產(chǎn)生熱效應(yīng)和空穴作用，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得松散，溶解性增加，使得蛋白質(zhì)可用自由氨基的數(shù)目顯著增加，增加大豆分離蛋白與多糖分子的碰撞幾率，提高大豆分離蛋白-多糖的接枝度，進(jìn)而反映出大豆分離蛋白和多糖在超高壓作用下結(jié)合的程度。

圖3 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物接枝度的測(cè)定

2.4 大豆分離蛋白-多糖超高壓復(fù)合物傅里葉紅外光譜分析

大豆分離蛋白與多糖通過(guò)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理形成復(fù)合物，使復(fù)合物的紅外光譜與大豆分離蛋白單物質(zhì)相比產(chǎn)生影響。如圖4所示，大豆分離蛋白與多糖形成的復(fù)合物的特殊吸收峰的峰寬明顯增大，主要是由于多糖與蛋白結(jié)合后其羥基含量增加。N—H伸縮振動(dòng)峰位置發(fā)生不同方向偏移，這是由于大豆分離蛋白與多糖經(jīng)過(guò)高壓處理后，大豆分離蛋白中的氫鍵發(fā)生不同變化。酰胺I帶在1 636 cm-1吸收峰變強(qiáng)，并且譜帶的最高點(diǎn)發(fā)生遷移，酰胺基譜帶向低波數(shù)遷移（藍(lán)移）說(shuō)明β-折疊增多。酰胺基譜帶的變化說(shuō)明不同多糖與大豆分離蛋白復(fù)合，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響程度各不相同。

圖4 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物紅外光譜圖

2.5 內(nèi)置熒光光譜分析

由于蛋白質(zhì)中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，這些基團(tuán)是所有天然氨基酸中僅有的發(fā)熒光基團(tuán)的氨基酸，是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的主要來(lái)源。蛋白質(zhì)溶液的熒光淬滅就是指溶液中淬滅分子與熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用，導(dǎo)致熒光物質(zhì)的熒光量子效率降低或者激發(fā)態(tài)壽命縮短，進(jìn)而導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度降低。由圖5可知，在存在多糖的條件下，通過(guò)動(dòng)態(tài)超高壓處理形成的復(fù)合物溶液中，熒光強(qiáng)度均明顯減弱，這是由于淬滅體（多糖）和熒光發(fā)光體（SPI）之間通過(guò)超高壓的作用相互碰撞，形成不發(fā)光的配合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的過(guò)程。復(fù)合物溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生位移變化，向低波長(zhǎng)方向移動(dòng)（藍(lán)移），也證明大豆分離蛋白-多糖在超高壓的作用下，環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，形成的復(fù)合物趨向于折疊狀態(tài)。

圖5 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物內(nèi)置熒光光譜圖

2.6 圓二色光譜分析

蛋白質(zhì)中生色基團(tuán)主要是由肽鏈中的肽鍵、芳香氨基酸殘基、二硫鍵等。圓二色譜的遠(yuǎn)紫外區(qū)段波長(zhǎng)為190~250 nm，主要的生色團(tuán)為肽鍵。參照待測(cè)蛋白質(zhì)或者多肽的遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色譜圖，可以推測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)或者肽鍵相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)或者肽鍵的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖6可知，大豆分離蛋白在185 nm和208 nm處左右有2個(gè)負(fù)的肩峰，經(jīng)過(guò)DHPM處理，形成的大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物在208 nm處附近呈現(xiàn)出正峰，在222 nm處附近出現(xiàn)負(fù)峰。由表1可以看出，多糖與大豆分離蛋白通過(guò)超高壓結(jié)合，導(dǎo)致β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲均發(fā)生變化，SPI-G、SPI-CH和SPI-CA這3種復(fù)合物β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量均增多（p＜0.05），二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這可能歸因于在動(dòng)態(tài)超高壓處理下，大豆分離蛋白由空化、剪切、高速撞擊和高頻振動(dòng)引起大豆分離蛋白發(fā)生折疊，所以形成的復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化。

表1 不同壓力下大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分含量

圖6 大豆分離蛋白-多糖復(fù)合物圓二色光譜圖

3 結(jié)論

SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明，DHPM處理大豆分離蛋白和多糖，出現(xiàn)新條帶，使得大豆分離蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變小，形成相對(duì)分子質(zhì)量較小的復(fù)合物。

結(jié)合紫外光譜、接枝度、傅里葉紅外光譜、內(nèi)置熒光光譜和圓二色光譜的分析結(jié)果可知，大豆分離蛋白與多糖（G、CH和CA）在動(dòng)態(tài)超高壓作用下形成的復(fù)合物，紫外光譜2個(gè)特征峰均呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，表現(xiàn)為減色效應(yīng)，吸收峰的峰位發(fā)生藍(lán)移；與對(duì)照組（SPI）相比較，溶液接枝度顯著增加；復(fù)合物紅外光譜特殊吸收峰的峰寬明顯增大，酰胺I帶在1 636 cm-1吸收峰變強(qiáng)，并且譜帶的最高點(diǎn)發(fā)生藍(lán)移；熒光光譜顯示復(fù)合物熒光強(qiáng)度均明顯減弱，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移；圓二色光譜顯示多糖與大豆分離蛋白通過(guò)超高壓結(jié)合，導(dǎo)致β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲均發(fā)生變化，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。試驗(yàn)結(jié)果顯示大豆分離蛋白與多糖在超高壓作用下有效結(jié)合，形成復(fù)合物。