酶法輔助PEG-200超聲波提取葵花籽仁中綠原酸的工藝優(yōu)化

劉霞，廖梅香，羅江浩

贛南醫(yī)學(xué)院（贛州 341000）

菊科植物向日葵（Helianthus annuusL.）系一年生草本植物，別名葵花、草天葵、望日蓮、太陽花、朝陽葵等[1]。向日葵的種子（葵花籽）中油脂含量豐富，含有超過85%的不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸中又含有近65%的亞油酸[2]，此外葵花籽中還具有葵花籽蛋白和綠原酸等物質(zhì)。目前我國對向日葵的使用加工僅限于油脂的提取[3]，關(guān)于葵花籽中綠原酸的提取卻較少提及。綠原酸作為葵花籽發(fā)揮藥理作用的有效成分之一，具有抑菌消炎、促進(jìn)凝血、清除體內(nèi)自由基、維持血糖平衡、預(yù)防心腦血管疾病等多種功效[4]。另外，綠原酸還因其抗炎、抗氧化、抑菌和防輻射的藥效被廣泛用于食品、化妝品和化工等領(lǐng)域[5-7]。正因?yàn)榫G原酸在各領(lǐng)域上的廣泛使用，對綠原酸的提取就顯得意義重大。

目前，采用酶法輔助PEG-200超聲波提取葵花籽仁中綠原酸的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)以葵花籽仁為原材料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化工藝條件，為葵花籽仁綠原酸的深入研究做準(zhǔn)備，并為其綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葵花籽仁，市售；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，天津一方科技有限公司；纖維素酶（5×104U·g-1），江蘇銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光譜儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；ME104/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；202A-2型電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[8]綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法。精密稱取10.16 mg于120 ℃減壓干燥至恒重的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，并用體積分?jǐn)?shù)為30% PEG-200定容，搖勻，即得101.6 μg·mL-1的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL該綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，分別加體積分?jǐn)?shù)為30% PEG-200至刻度，搖勻，靜置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最大吸收波長329 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.051C+0.003 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.2.2 葵花籽仁綠原酸的提取過程

葵花籽仁→烘干→粉碎→過篩→脫脂（用一定比例的石油醚）→溶解（體積分?jǐn)?shù)為30%的PEG-200）→調(diào)節(jié)pH→酶解（加纖維素酶）→超聲提?。?0 ℃）→趁熱過濾→濾液減壓濃縮→定容

4.腹部按摩，從右下腹開始，以輕柔力道做順時(shí)鐘方向按摩，每次10～20圈，一天2～3次，可幫助舒緩腹脹感。

1.2.3 綠原酸提取率測定

將上述提取液按一定比例稀釋后，按1.2.1的測定方法測定吸光度，并計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

選取酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液固比及超聲時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究它們對葵花籽仁綠原酸提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9]

試驗(yàn)的水平因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對綠原酸提取率的影響

由圖1可知：當(dāng)酶用量為0~1.0%時(shí)，綠原酸提取率逐步增大；當(dāng)酶用量為1.0%時(shí)，綠原酸的提取率達(dá)到最大值3.24%；后續(xù)增大酶用量，綠原酸提取率開始下降。這是因?yàn)榍捌陔S著酶用量的增加，酶與底物接觸概率增大，酶解反應(yīng)速率加快；后續(xù)增加酶用量，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)中底物濃度相對不夠，酶促反應(yīng)速度下降，因而綠原酸浸出率降低[10]。因此最佳試驗(yàn)條件選擇1.0%酶用量。

圖1 酶用量對綠原酸提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

圖2 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對綠原酸提取率的影響

由圖3可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，綠原酸提取率先逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，提取率達(dá)到峰值3.34%，之后隨著酶解時(shí)間的增加，提取率緩緩下降。這是因?yàn)榫G原酸本身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長時(shí)間加熱或見光的條件將其易氧化分解[11]，因而提取率降低。因此試驗(yàn)將酶解時(shí)間定為1.5 h。

圖3 酶解時(shí)間對綠原酸提取率的影響

2.1.4 液固比對綠原酸提取率的影響

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)液固比越大，綠原酸提取率越高。當(dāng)液固比為20∶1（mL/g）時(shí)，綠原酸提取率可達(dá)峰值3.42%，之后綠原酸提取率開始逐步下降。這是因?yàn)镻EG-200作為非離子型表面活性劑，可明顯降低界面張力，增加細(xì)胞膜的滲透性；此外PEG與水混合后形成膠束，綠原酸的非極性基團(tuán)可進(jìn)入膠束內(nèi)核被增溶，使綠原酸更易溶于水中。而液固比超過其最佳比后，其他物質(zhì)也會(huì)相應(yīng)進(jìn)入膠束內(nèi)核，占據(jù)一定的體積后被增溶[12]，使綠原酸的溶出減少，提取量反而降低。因此選擇20∶1（mL/g）為最佳液固比。

圖4 液固比對綠原酸提取率的影響

2.1.5 超聲時(shí)間對綠原酸提取率的影響

由圖5可知：超聲時(shí)間對綠原酸提取率的影響是一個(gè)先急速上升后緩緩下降的過程；當(dāng)在超聲時(shí)間為30 min時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到峰值3.39%，之后提取率開始下降，因此選擇30 min為最佳超聲時(shí)間。

圖5 超聲時(shí)間對綠原酸提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2進(jìn)行回歸擬合，得出方差分析表，見表3。

表2 Box-behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

經(jīng)過二次回歸擬合分析獲得葵花籽仁中綠原酸提取率（Y）與酶用量（A）、酶解時(shí)間（B）、液固比（C）和超聲時(shí)間（D）之間的擬合方程：Y=1.345 4+0.295 0A+3.720 0B-0.068 8C-5.000 0E-004D-0.610 0AB+0.093 0AC-5.500 0E-003AD-0.052 0BC+7.000 0E-003BD+1.850 0E-003CD-0.615 0A2-0.845 0B2-3.000 0E-004C2-5.750 0E-004D2。

由表3可知：回歸方程的p＜0.01，表明該回歸模型達(dá)到極顯著水平。該擬合模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.966 5，調(diào)整系數(shù)Radj2=0.933 0，均大于90%，表明回歸模型擬合良好，試驗(yàn)誤差小，可用于擬合酶法輔助PEG-200提取葵花籽仁中綠原酸的過程。一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AC、BC、CD，二次項(xiàng)A2、B2、D2的p值均小于0.05，表明酶用量、酶解時(shí)間、液固比和超聲時(shí)間對葵花籽仁中綠原酸的提取量均有顯著影響，且影響順序（主→次）為酶解時(shí)間＞酶用量＞超聲時(shí)間＞液固比。交互項(xiàng)AB、AC、BC、CD的p值均小于0.01，表明酶用量與酶解時(shí)間、酶用量與液固比、酶解時(shí)間與液固比、液固比與超聲時(shí)間的交互作用對葵花籽仁中綠原酸的提取量均有極其顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析及最佳提取工藝研究

各試驗(yàn)因素間的交互作用對葵花籽仁綠原酸提取率的影響可從響應(yīng)曲面圖直觀地觀察。由圖6可以看出：酶用量與酶解時(shí)間、酶用量與液固比對葵花籽仁綠原酸提取率具有最顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面比較陡峭；酶解時(shí)間與液固比、液固比與超聲時(shí)間交互作用的影響次之，表現(xiàn)為曲面坡度稍平緩。各試驗(yàn)因素間的交互作用對葵花籽仁綠原酸提取率的影響與表3中的方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，最佳工藝參數(shù)確定為酶用量0.5%、酶解時(shí)間1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超聲時(shí)間32 min。在此工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際得到的提取率為3.49%，與預(yù)測值3.55%相差較小，相對誤差為1.69%，表明該模型可以較好地?cái)M合葵花籽仁綠原酸的提取過程。

2.3 不同提取方法的對比

由表4可知：與超聲法相比，酶法聯(lián)合超聲法提取葵花籽仁中綠原酸雖耗時(shí)更長，但提取率增加近1倍；與酶法聯(lián)合回流法相比，提取時(shí)間縮短，提取率卻增加，這可能與綠原酸在長時(shí)間高溫條件下發(fā)生水解和氧化有關(guān)。由此說明酶法聯(lián)合超聲法可顯著提高葵花籽仁中綠原酸的得率。

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中綠原酸的比較（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中綠原酸的比較（±s，n=3）

序號(hào) 提取方法 提取時(shí)間 葵花籽仁綠原酸提取率/%1 酶法聯(lián)合超聲法 134 min 3.49±0.35 2 超聲法 30 min 2.03±0.24 3 酶法聯(lián)合回流法 3.5 h 3.08±0.17

3 討論與結(jié)論

通過響應(yīng)面分析方法的優(yōu)化，采用酶法輔助PEG-200提取葵花籽仁中綠原酸的最佳工藝條件為酶解溫度50 ℃、酶用量0.5%、酶解時(shí)間1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超聲時(shí)間32 min。在此工藝條件下實(shí)際提取率為3.49%，相對誤差為1.69%，表明該設(shè)計(jì)方法對葵花籽仁綠原酸提取工藝的優(yōu)化具有可行性。該方法與超聲法單技術(shù)相比，雖耗時(shí)更長，但提取率增加近1倍；與酶法聯(lián)合回流法相比，該方法提取時(shí)間縮短，提取率卻增加，這可能與綠原酸在長時(shí)間高溫條件下發(fā)生水解和氧化有關(guān)。由此說明酶法聯(lián)合超聲法可顯著提高葵花籽仁中綠原酸的得率。該研究結(jié)果可為葵花籽綠原酸的提取提供一定的參考依據(jù)和借鑒作用。