黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠腹瀉模型的干預(yù)作用

凌智輝，張?zhí)炻梗▏?guó)，唐 其，吳領(lǐng)席，陸 英，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128;2.國(guó)家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省通道縣農(nóng)業(yè)局，懷化 418000)

黑老虎(Kadsuracoccinea(Lem.) A. C. Smith)別名冷飯團(tuán)、過(guò)山龍?zhí)?、血藤泡、布福娜等，是木蘭科、南五味子屬藤本類(lèi)植物。黑老虎作為一種民間藥物，藥物部位主要為根、莖，味辛、微苦、性溫，具有行氣止痛、散淤通絡(luò)的功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、胃病及婦科病等[1]?，F(xiàn)代研究表明，黑老虎根莖中主要化學(xué)成分有木質(zhì)素類(lèi)和三萜類(lèi)，還有單萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、甾體類(lèi)等，其中木脂素類(lèi)化合物主要為聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類(lèi)，還有少量的芳基萘型和二芐基丁烷型木脂素類(lèi)[2]，其他類(lèi)型木脂素主要為芳基萘型木脂素 kadsuralignan C[3]、kadsuralignans H[4]和二芐基丁烷型木脂素 kadsuralignan G[5]；三萜類(lèi)化合物有kadlongilactone型以及降三萜類(lèi)等[6-7]；倍半萜有l(wèi)ospathulenol和naphthalene C等[8]。黑老虎中所得木脂素類(lèi)化合物主要有抗腫瘤[9]、抗HIV[10]、保肝作用[11]、抗炎作用[12]；三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤[13]、保肝作用[14]；其他類(lèi)化合物還有抗氧化、調(diào)血脂、體外抑菌、殺蟲(chóng)、神經(jīng)保護(hù)等作用[15]。

近年來(lái)，黑老虎果實(shí)作為一種特色水果在我國(guó)南方發(fā)展速度較快，種植面積快速增加，但黑老虎果實(shí)存在果皮厚，籽多，果肉量少的缺點(diǎn)，亟待深加工綜合開(kāi)發(fā)利用；筆者在黑老虎種植基地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)乩习傩沼杏煤诶匣⒐ぶ委煾篂a的案例，但未發(fā)現(xiàn)科學(xué)研究報(bào)導(dǎo)。腹瀉是人畜共患的一種多種因素引起的腸道疾病，多采用抗生素進(jìn)行治療。近年來(lái)，由于抗生素類(lèi)藥物的大量使用，導(dǎo)致藥物殘留和環(huán)境污染等問(wèn)題，具有抗腹瀉作用的天然植物提取物替代抗生素成為人們研究的熱點(diǎn)。采用細(xì)菌性腹瀉小鼠和藥物性腹瀉小鼠模型對(duì)黑老虎果實(shí)提取物的主要成分及抗腹瀉作用進(jìn)行研究，為新藥開(kāi)發(fā)和畜禽養(yǎng)殖中疾病預(yù)防及治療提供新的天然抗腹瀉藥物，也為黑老虎產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR小鼠210只，體重：18.0～22.0 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107272011000001，1107272011000003，1107272011000329，在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0016。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 黑老虎鮮果2019年11月采集于湖南省懷化市通道縣黑老虎種植基地；大腸埃希氏菌Escherichia coli(ATCC25922)；羧甲基纖維素鈉，批號(hào)：20170915，阿拉丁產(chǎn)品；蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備 ME2002E型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 提取物制備 取黑老虎鮮果4000 g，用10倍40%乙醇在30 ℃超聲提取三次，每次60 min,將提取液抽濾并合并，55 ℃減壓回收乙醇，濃縮后冷凍干燥得黑老虎果實(shí)提取物。

1.3.2 提取物中主要成分含量檢測(cè) 分別以五味子酯甲、齊墩果酸、蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，按文獻(xiàn)[16-18]方法采用分光光度法測(cè)定黑老虎果實(shí)提取物中的木脂素類(lèi)、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物含量。

1.3.3 劑量設(shè)置 設(shè)置黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。腸炎寧膠囊臨床推薦用量6 g，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算動(dòng)物等效劑量為6 g*0.0026/0.02 kg=0.78 g/kg。

1.3.4 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠細(xì)菌性腹瀉模型的影響 ICR小鼠60只，雄性，體重18.0～22.0 g，按體重隨機(jī)分為6組，每組小鼠10只，分別為：正常組、腸炎寧膠囊組、模型組、黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組。不同小組小鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求灌胃給予不同藥物(表1)，連續(xù)給藥7 d，給藥體積為0.4 mL，每日給藥1次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠每天給予同體積蒸餾水。除正常組其余小鼠于末次給藥后30 min腹腔注射5×108CFU/mL的大腸埃希菌溶液，注射體積為0.4 mL。觀察并記錄各組小鼠注射大腸埃希菌后4 h內(nèi)排便情況[19]，并計(jì)算小鼠腹瀉率與腹瀉指數(shù)。腹瀉率=腹瀉動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%；腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。稀便率為小鼠所排的稀便數(shù)與總便數(shù)之比。稀便級(jí)通過(guò)稀便濾紙的污染程度(直徑大小)來(lái)進(jìn)行分級(jí)，一共分為4級(jí)：小于1 cm為1級(jí)，1～1.9 cm為2級(jí)，2～3 cm為3級(jí)，大于3 cm為4級(jí)，不同級(jí)數(shù)表示每只動(dòng)物稀便的程度的高低。平均稀便級(jí)=所有稀便級(jí)/稀便次數(shù)[20]。

表1 試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)

1.3.5 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響 ICR小鼠50只，雄性，體重：18.0～22.0 g，按體重隨機(jī)分為5組，小鼠同1.4.3方法處理。除正常組其余小鼠于末次給藥后30 min灌胃給予1 g/mL的番瀉葉提取液，灌胃體積為0.4 mL，灌胃后將小鼠單個(gè)置于自制鐵絲籠中，下方墊濾紙，濾紙間隔30 min更換1次，記錄小鼠首次出現(xiàn)腹瀉時(shí)間與6 h內(nèi)稀便數(shù)量。

1.3.6 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響ICR小鼠50只，雌雄各半，體重：18.0～22.0 g，按性別體重隨機(jī)分為5組，分別為：正常組、腸炎寧膠囊組、黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組，每組10只，每天小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃藥物劑量0.4 mL的相應(yīng)藥物，1次每日，連續(xù)7天進(jìn)行給藥，正常組小鼠灌胃0.4 mL蒸餾水，各組小鼠末次給藥后30 min灌胃給予5%碳末，0.2 mL/只，30 min后處死小鼠，參照文獻(xiàn)方法[21]，計(jì)算小腸碳末推進(jìn)率。碳末推進(jìn)率(%)=碳末在腸內(nèi)推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑老虎主要化學(xué)成分定量檢測(cè) 由圖1可見(jiàn)，三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99，證明該方法線性范圍良好，可用于含量測(cè)定。黑老虎果實(shí)提取物中木脂素、三萜和黃酮類(lèi)化合物總量達(dá)到63%，其中木脂素類(lèi)化合物含量最高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 黑老虎果實(shí)提取物中主要化學(xué)成分含量

2.2 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠細(xì)菌性腹瀉模型的影響 由表3可知，模型對(duì)照組相對(duì)于正常組，小鼠的腹瀉潛伏時(shí)間明顯減少(P<0.01)，小鼠腹瀉指數(shù)明顯增加(P<0.01)，表明造模成功。相對(duì)于模型組，腸炎寧組、黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時(shí)間均有所延長(zhǎng)，腹瀉指數(shù)有所減少，其中黑老虎果實(shí)提取物低、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時(shí)間明顯增加(P<0.05)，高劑量組腹瀉指數(shù)明顯減少(P<0.05)。黑老虎果實(shí)提取物低、中、高組小鼠腹瀉率分別是：40%、40%、20%，相對(duì)于模型組都有所減少。黑老虎果實(shí)提取物高劑量組潛伏時(shí)間顯大于腸炎寧組，腹瀉指數(shù)顯小于腸炎寧組，腹瀉率低于腸炎寧組。

表3 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠細(xì)菌性腹瀉模型的影響(n=10)

2.3 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響 如表4所示，相比于正常組，模型組小鼠腹瀉潛伏時(shí)間明顯減少(P<0.05)，稀便數(shù)量明顯增加(P<0.01)。相對(duì)于模型組，腸炎寧膠囊組潛伏時(shí)間明顯減少(P<0.05)，稀便數(shù)量有所減少，但不明顯；黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時(shí)間都沒(méi)有明顯改變，稀便數(shù)量都有明顯減少(P<0.05)。相比于腸炎寧組，黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組潛伏時(shí)間都增加，稀便數(shù)量都有所減少；黑老虎低劑量組稀便顆數(shù)有顯著差異。

表4 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響(n=10)

2.4 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響 由表5可知，與正常組相比，黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組小鼠小腸碳末推進(jìn)率無(wú)明顯差異(P>0.05)，腸炎寧膠囊組小鼠小腸碳末推進(jìn)率有所增加。與腸炎寧膠囊組相比，黑老虎果實(shí)提取物低、中、高劑量組小鼠小腸碳末推進(jìn)率有所減少，但無(wú)顯著差異。

表5 黑老虎果實(shí)提取物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響(n=10)

3 討論與結(jié)論

文獻(xiàn)研究表明，具有抗腹瀉的天然化學(xué)成分主要有鞣質(zhì)類(lèi)[23]、生物堿類(lèi)[24-25]、三萜類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)[26]、黃酮類(lèi)[27]、多酚類(lèi)[27]、多糖及其他類(lèi)化合物，主要從調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)平衡、抗炎、干預(yù)胃腸激素分泌、保護(hù)腸黏膜、促進(jìn)腸道修復(fù)等方面作用；實(shí)驗(yàn)對(duì)黑老虎果實(shí)提取物中主要成分測(cè)定表明，提取物中含有較高的木脂素、三萜和黃酮類(lèi)化合物，這三類(lèi)成分均具有較好的抗炎作用。因此，可以推測(cè)，它們是黑老虎果實(shí)提取物具有抗腹瀉作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，且主要是通過(guò)抑制腸道炎癥而產(chǎn)生抗腹瀉作用，但具體作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究，具體化學(xué)組成也有待進(jìn)一步分離與鑒定。

黑老虎果實(shí)提取物對(duì)細(xì)菌性致腹瀉具有良好的抗腹瀉作用，為新藥開(kāi)發(fā)和畜禽養(yǎng)殖中疾病預(yù)防及治療提供了新的天然抗腹瀉藥物，也為黑老虎產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。