鹽酸頭孢噻呋無(wú)菌檢查方法的建立

劉霄飛,徐恩民*，張 琦，馮修光，郭 騰，章安源，王 燕

(1.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，濟(jì)南 250102；2.山東省飼料獸藥檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102)

鹽酸頭孢噻呋，別名頭孢噻呋鹽酸鹽，鹽酸頭孢替呋，頭孢替呋鹽酸鹽，屬于第三代頭孢菌素類(lèi)抗生素。頭孢噻呋作為第一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于動(dòng)物的第三代頭孢菌素類(lèi)抗生素，因其具備抗菌活性強(qiáng)，β-內(nèi)酰胺環(huán)穩(wěn)定性好，毒副作用小，殘留量低，不易產(chǎn)生耐藥性或交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，其制劑在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用于防治豬、牛、羊及雛雞的呼吸系統(tǒng)等疾病[1-3]。鹽酸頭孢噻呋在《中華人民共和國(guó)獸藥典》尚未收載，其無(wú)菌檢查的方法也未見(jiàn)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有農(nóng)業(yè)部865號(hào)公告和1140號(hào)公告，且兩個(gè)公告的檢測(cè)對(duì)象為非無(wú)菌原料，均沒(méi)有無(wú)菌檢查項(xiàng)目。鹽酸頭孢噻呋無(wú)菌原料供無(wú)菌制劑使用時(shí)，存在一定的安全隱患。為了更好的對(duì)該無(wú)菌原料進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制，確保其無(wú)菌制劑臨床用藥的安全性，本試驗(yàn)對(duì)鹽酸頭孢噻呋無(wú)菌原料的無(wú)菌檢查方法進(jìn)行研究，建立可靠的無(wú)菌檢查方法并進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 SHP150型生化培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KB240型生化培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER)；BT125D型電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HTY-APL01型集菌儀(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)；HG-50型全自動(dòng)滅菌鍋(HIRAYAMA株式會(huì)社)；KDGB330型全封閉無(wú)菌過(guò)濾培養(yǎng)器(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)。

1.1.2 供試品 鹽酸頭孢噻呋無(wú)菌原料分別由艾美科健生物醫(yī)藥有限公司(批號(hào)：PS077-1802001)；齊魯晟華制藥有限公司(批號(hào)：80671025A)。

1.1.3 試驗(yàn)菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]和黑曲霉[CMCC(B)98003]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.4 培養(yǎng)基與試劑 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào)：180830)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：180820)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：180820)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)：180731)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：180912)、0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液(批號(hào)：180226)和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：180820)，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。無(wú)水碳酸鈉(批號(hào)：20180125)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。頭孢菌素酶(β-內(nèi)酰胺酶Ⅱ，規(guī)格：不少于200萬(wàn)單位/支，批號(hào)：7041837D)購(gòu)自杭州北望生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 首先將試驗(yàn)所需的7種菌分別進(jìn)行復(fù)蘇復(fù)壯。再將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，將生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h；將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，再加入3～5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的 0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，制成孢子懸液。上述培養(yǎng)物和孢子懸液均用0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1 mL含活菌數(shù)/孢子數(shù)<100 CFU的菌懸液，培養(yǎng)后活菌計(jì)數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)基適用性檢查

1.2.2.1 培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查 隨機(jī)取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各5支，置規(guī)定的溫度下培養(yǎng)14 d。

1.2.2.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種<100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單包菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3 d；取每管裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5 d。

1.2.3 供試品前處理 取供試品500 mg，加10 mL 2.6%無(wú)菌碳酸鈉溶液使溶解，再轉(zhuǎn)移至490 mL 0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液中，作為供試液過(guò)濾。

1.2.4 沖洗總量的考察 選擇常用的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，分別對(duì)供試品進(jìn)行300、400、500 mL/膜的沖洗后，加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌，30～35 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.5 無(wú)菌檢查法適用性試驗(yàn)(薄膜過(guò)濾法)

1.2.5.1 供試品陽(yáng)性菌試驗(yàn)組 用建立的方法對(duì)供試品進(jìn)行操作，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的菌液，過(guò)濾后，每個(gè)濾筒內(nèi)灌注培養(yǎng)基，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃條件下培養(yǎng)5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，各2組。

1.2.5.2 陽(yáng)性菌對(duì)照組 取6個(gè)無(wú)菌封閉式濾筒，其中3個(gè)濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，分別接種<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌，30～35 ℃條件下培養(yǎng)5 d；另3個(gè)濾筒加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，分別接種<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，20～25 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.5.3 供試品組 取供試品，除不加陽(yáng)性菌外，與供試品陽(yáng)性菌試驗(yàn)組同法處理。再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)5 d。

1.2.5.4 陰性對(duì)照組 取2個(gè)無(wú)菌封閉式濾筒，用0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液和pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗次數(shù)與沖洗量與試驗(yàn)組相同，向?yàn)V筒中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)5 d。

1.2.6 加酶與否的考察 與1.2.5.1項(xiàng)和1.2.5.3項(xiàng)同法操作，并在每筒培養(yǎng)基內(nèi)加入一支用1 mL 0.85%無(wú)菌氯化鈉溶液溶解的頭孢菌素酶溶液進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 活菌計(jì)數(shù) 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，經(jīng)倍比稀釋后，7種菌的菌懸液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果均符合要求，可作為試驗(yàn)菌液。

表1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 培養(yǎng)基適用性檢查

2.2.1 培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查 經(jīng)培養(yǎng)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基均無(wú)菌生長(zhǎng)，表明這兩種培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查符合要求。

2.2.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 培養(yǎng)基靈敏度檢查結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各試驗(yàn)菌株在對(duì)應(yīng)的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)特定的時(shí)間培養(yǎng)后均生長(zhǎng)良好，空白對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)，表明這兩種培養(yǎng)基的靈敏度符合要求。

表2 培養(yǎng)基靈敏度檢查結(jié)果

2.3 沖洗總量 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，300、400 mL/膜的沖洗筒，菌雖然生長(zhǎng)，但較陽(yáng)性對(duì)照筒生長(zhǎng)得弱一些，500 mL/膜沖洗筒，菌生長(zhǎng)良好，與陽(yáng)性對(duì)照筒生長(zhǎng)情況相同，表明供試品抑菌作用完全消除。因此，確定沖洗總量為500 mL/膜(每張濾膜每次沖洗量為100 mL，沖洗5次)。

表3 沖洗總量考察結(jié)果

2.4 方法適用性試驗(yàn) 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、表5，由表4、表5可知，6種試驗(yàn)菌株均生長(zhǎng)良好，表明該試驗(yàn)方法能有效消除鹽酸頭孢噻呋對(duì)各試驗(yàn)菌株的影響。

表4 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(供試品陽(yáng)性菌試驗(yàn)組與陽(yáng)性菌對(duì)照組)

表5 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(供試品組與陰性菌對(duì)照組)

2.5 加酶與否 通過(guò)加酶與否考察試驗(yàn)得出，加頭孢菌素酶與不加頭孢菌素酶，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響，說(shuō)明供試品經(jīng)500 mL/膜pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液充分沖洗后，可完全消除供試品自身的抑菌作用，不需另加頭孢菌素酶來(lái)中和供試品的抑菌活性。

2.6 供試品無(wú)菌檢查 分別取兩個(gè)廠(chǎng)家的供試品，按照驗(yàn)證過(guò)的無(wú)菌檢查方法進(jìn)行檢查。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照菌在24 h內(nèi)均生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照14 d內(nèi)均澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，供試品14 d內(nèi)澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)菌檢查結(jié)果符合規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品的取樣量及溶解介質(zhì) 鹽酸頭孢噻呋不溶于水，由其分子式可知鹽酸頭孢噻呋在水中顯酸性，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證能夠在碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液中溶解[4]?？紤]到溶解介質(zhì)對(duì)微生物的影響并借鑒頭孢噻呋的無(wú)菌檢查方法[5]，本試驗(yàn)選用2.6%無(wú)菌碳酸鈉溶液作為溶解介質(zhì)。供試品取樣量依據(jù)無(wú)菌檢查法供試品的最少檢驗(yàn)量[5]的要求，選擇了最少檢驗(yàn)量500 mg，通過(guò)逐步增加溶解介質(zhì)觀(guān)察供試品溶解情況的方法，最終確定500 mg的供試品在10 mL 2.6%無(wú)菌碳酸鈉溶液中完全溶解。

3.2 沖洗液的用量 無(wú)菌檢查常見(jiàn)方法有直接接種法和薄膜過(guò)濾法，只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法[5]。薄膜過(guò)濾法是各國(guó)藥典收載的無(wú)菌檢查的首選方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[6]。薄膜過(guò)濾法每張濾膜總沖洗量不得超過(guò)1000 mL，以免濾膜上的微生物受損傷[5]；一般要求固體供試品溶解后轉(zhuǎn)移至不少于500 mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋后再過(guò)濾，因此，沖洗液的用量不能超過(guò)500 mL，使總過(guò)濾量不超過(guò)1000 mL，以保證微生物檢出不受影響。

3.3 β-內(nèi)酰胺酶的使用 鹽酸頭孢噻呋屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，具有很強(qiáng)的抑菌作用[7]，具有抑菌活性的供試品無(wú)菌檢查時(shí)可以加入中和劑或滅活劑來(lái)消除供試品的抑菌活性[8]，本試驗(yàn)對(duì)加β-內(nèi)酰胺酶與不加β-內(nèi)酰胺酶兩種方法做了比較，發(fā)現(xiàn)供試品經(jīng)500 mL/膜pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液充分沖洗后，可完全消除供試品自身的抑菌作用，不需要另加β-內(nèi)酰胺酶中和，大大降低了試驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。

本試驗(yàn)成功建立了鹽酸頭孢噻呋無(wú)菌原料的無(wú)菌檢查方法。在該無(wú)菌檢查條件下可有效清除藥物自身的抑菌活性，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，為該無(wú)菌原料的安全性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供了科學(xué)、可靠的技術(shù)支持。