ARA55過表達(dá)激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導(dǎo)CNE2鼻咽癌細(xì)胞凋亡①

崔兆磊 辛小琴 陳 燕 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科生物化學(xué)分子生物學(xué)研究室，福州350014）

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，以發(fā)病地域性強(qiáng)，惡性度高，易轉(zhuǎn)移等為特點(diǎn)［1］。由于缺乏靈敏度高的標(biāo)志物，很多患者失去早期診斷的機(jī)會。雄激素受體相關(guān)蛋白55（androgen receptor coactivator 55 kD protein，ARA55）是雄激素受體輔助因子（androgen receptor coactivator，ARA）的重要成員之一，其表達(dá)主要見于人前列腺基質(zhì)細(xì)胞，可作為一種輔助激活因子通過介導(dǎo)蛋白間的相互作用或磷酸化水平等調(diào)節(jié)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性［2］。目前關(guān)于ARA55 在惡性腫瘤中發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能研究者尚未達(dá)成一致。研究顯示，ARA55 可能是一種抑癌基因，因其在部分惡性腫瘤包括前列腺癌、胰腺癌以及食管鱗癌等的癌組織表達(dá)明顯降低，而在相應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)升高［3-5］。然而有研究發(fā)現(xiàn)ARA55 在癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時的形態(tài)改變及可塑性等過程中發(fā)揮重要作用［6］。目前，ARA55 在鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究擬探討ARA55基因/蛋白表達(dá)上調(diào)對CNE2 鼻咽癌生長增殖和侵襲遷移等生物學(xué)特性的影響，同時探討相應(yīng)的分子機(jī)制，以期明確ARA55在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV-ARA55-EGFP 重組質(zhì)粒為前期構(gòu)建［7］。RPMI1640 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、雙抗（Hy‐clone 公司）。ZLip2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（北京莊盟）、CCK-8（日本同仁）、Annexin V-PE/7-AAD 凋亡試劑盒（南京凱基）；DNA Ladder 抽提、BCA 法蛋白定量、SDS-PAGE 凝膠和RIPA 蛋白提取等試劑盒、鼠抗人Caspase-3、Cytochrome C 和 β-actin 單克隆抗體等均為碧云天產(chǎn)品。鼠抗人ARA55單克隆抗體、兔抗人Caspase-9 多克隆抗體（Santa Cruz 公司）。兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人CNE2 鼻咽癌細(xì)胞為本實驗室保存。培養(yǎng)基為RPMI1640（含10%FBS 及1%雙抗），細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2飽和濕度的37℃恒溫箱，每3~5 d 傳代1 次。前期構(gòu)建的pCMV-ARA55-EGFP 重組質(zhì)粒經(jīng)ZLip2000 轉(zhuǎn)染至CNE2 細(xì)胞。實驗設(shè)ARA55 過表達(dá)組（pCMVARA55-EGFP）、空載體組（mock control）和空白對照組（blank control）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24~48 h 經(jīng)熒光顯微鏡觀察是否有EGFP的表達(dá)，判斷質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.2 CCK-8 比色實驗 選用96 孔培養(yǎng)板，每孔接種 5 000 個對數(shù)期的 CNE2 細(xì)胞，總體積 100 μl，各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)定時間點(diǎn)，在培養(yǎng)的24 h、48 h、72 h 加入CCK-8 試劑（10 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)2~3 h。檢測時需設(shè)置酶標(biāo)儀雙波長（450 nm和630 nm）模式，在此模式下檢測每孔細(xì)胞的OD 值（OD 值的大小與細(xì)胞的數(shù)量成正比），繪制細(xì)胞生長曲線，橫軸為培養(yǎng)時間，縱軸為檢測的OD 值。實驗每組含3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕修復(fù)實驗 實驗于6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔加 5×105個 CNE2 細(xì)胞，培養(yǎng)約 8～12 h，保證細(xì)胞單層不重疊，貼壁平鋪，細(xì)胞融合率應(yīng)該接近100%。選用無菌加樣槍的吸頭（200 μl 規(guī)格）垂直劃痕（用力盡量均勻，以保證劃痕邊緣整齊），用PBS洗滌，加入不含F(xiàn)BS 的RPMI1640 培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)于含5% CO2飽和濕度的37℃恒溫箱。于培養(yǎng)不同時間點(diǎn)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 Transwell 小室體外侵襲遷移實驗 侵襲實驗時，按1∶5體積比在無FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基中加入Matrigel 膠以檢測細(xì)胞的侵襲能力。在冰塊上充分混勻后，每個小室的上腔室各加100 μl（3 個室），37℃孵育4~5 h。在每孔中加入50 000個CNE2細(xì)胞，下腔室中加入500 μl 的RPMI1640 培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS的濃度為20%）。培養(yǎng)的不同時間點(diǎn)取出小室，用PBS 洗滌2~3 次，滴加濃度為5%的戊二醛固定20 min 以上。用Giemsa 染色液常溫染色5~10 min，顯微鏡統(tǒng)計結(jié)果［8］。Transwell 小室遷移實驗中不需用Matrigel膠包被基底膜，其他步驟同侵襲實驗。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，用胰酶消化各組細(xì)胞，PBS洗滌后離心收集細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml；按試劑盒相應(yīng)步驟加入Binding Buffer、Annexin V-PE染液、7-AAD染液等，盡快于流式細(xì)胞儀檢測［9］。

1.2.6 DNA 片段電泳檢測細(xì)胞凋亡片段生成情況 收集約1.0×106個細(xì)胞，胞重懸于PBS 中，依次加入RNase A，蛋白酶K，裂解液B，無水乙醇等提取基因組DNA，加入洗脫液約100 μl，在12 000/rmin條件下離心1 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，18 V 電泳 4~6 h［10］。

1.2.7 免疫印跡實驗 細(xì)胞總蛋白的提取采用RIPA蛋白裂解液，BCA法蛋白定量。配置10%分離膠和5%濃縮膠，電泳分離目的蛋白，110 V 恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗的濃度分別為：Bcl-2（1∶1 000），Bax（1∶300），Cy‐tochrome C（1∶500），Caspase-9（1∶200），Cleaved cas‐pase-3（1∶300），β-actin（1∶1 000）。4℃ 孵育過夜。用 TBST 洗 滌 吸 附 蛋 白 的 PVDF 膜 3 次 ，加 入 1∶10 000 TBST稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠抗體），放在搖床室溫環(huán)境中繼續(xù)孵育1~2 h，加ECL顯色液（A、B 液）后于蛋白成像儀中曝光顯影。βactin 為內(nèi)參照蛋白，蛋白進(jìn)行相對定量采用Image J軟件。

2 結(jié)果

2.1 pCMV-ARA55-EGFP轉(zhuǎn)染上調(diào)CNE2細(xì)胞中外源 性 ARA55 的表 達(dá) CNE2 細(xì) 胞轉(zhuǎn) 染 pCMVARA55-EGFP 重組質(zhì)粒 24 h 后即可觀察到 EGFP 的表達(dá)，熒光主要位于胞質(zhì)（圖1）。免疫印跡實驗在pCMV-ARA55-EGFP 組細(xì)胞中可檢測到分子量約為80 kD的融合蛋白ARA55-EGFP的表達(dá)（圖1）。

圖1 CNE2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)重組質(zhì)粒后ARA55-EGFP 融合蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of ARA55-EGFP fusion protein in re?combinant plasmids transfected CNE2 cells

2.2 外源性ARA55 表達(dá)抑制CNE2 細(xì)胞生長增殖 采用CCK-8 比色繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果顯示，隨時間的延長pCMV-ARA55-EGFP 組CNE2 細(xì)胞增殖受到抑制，72 h 的 OD 值為 0.540±0.031，而pCMV-C-EGFP 組和空白對照組 72 h 的 OD 分別為0.796±0.024 和 0.861±0.010。 ARA55 過 表 達(dá) 組48 h 和 72 h 的 OD 值與 pCMV-C-EGFP 組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 基于CCK-8實驗繪制的細(xì)胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve based on CCK-8 testing

2.3 ARA55 過表達(dá)抑制CNE2 細(xì)胞的體外遷移能力 劃痕修復(fù)實驗顯示（圖3），ARA55表達(dá)上調(diào)后，pCMV-ARA55-EGFP 組出現(xiàn)遷移的CNE2 細(xì)胞數(shù)量明顯低于空載體組（P<0.01），說明外源性ARA55可抑制CEN2細(xì)胞的體外遷移。

圖3 劃痕修復(fù)實驗檢測ARA55 過表達(dá)對CNE2 細(xì)胞體外遷移能力的影響Fig.3 Effects of ARA55 restoration on CNE2 cell migration assessed using wound healing migration assay

2.4 ARA55 對CNE2 細(xì)胞體外侵襲遷移能力的影響 體外侵襲實驗結(jié)果可見（圖4），pCMV-ARA55-EGFP 組發(fā)生侵襲和遷移的CNE2 細(xì)胞數(shù)量顯著少于空載體組和空白對照組，說明ARA55過表達(dá)可以抑制CNE2細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力。

圖4 Transwell 小室實驗檢測ARA55 過表達(dá)對CNE2 細(xì)胞體外侵襲遷移能力的影響Fig.4 Transwell invasion assay assessed effects of ARA55 overexpression on CNE2 cell migration and invasion

2.5 ARA55過表達(dá)誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞凋亡 采用An‐nexin V-PE/7-AAD 雙熒光標(biāo)記結(jié)合FCM 檢測CNE2細(xì)胞的凋亡率（早期+晚期凋亡），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后ARA55 過表達(dá)組的細(xì)胞總凋亡率可達(dá)52.8%，而空載體組凋亡率僅為7.2%（圖5）。DNA 梯狀電泳結(jié)果顯示，隨時間延長，ARA55 過表達(dá)組“梯狀”DNA 片段化程度越來越明顯。以上結(jié)果說明，過表達(dá)外源性ARA55可誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 Annexin V-PE/7-AAD 雙熒光標(biāo)記結(jié)合FCM 及DNA ladder分析細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis analysis by Annexin V-PE/7-AAD dou?ble staining/FCM and DNA ladder

2.6 免疫印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 免疫印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h 后，相對于其他兩對照組，ARA55 過表達(dá)組 Bcl-2 表達(dá)量顯著下調(diào)，Cyto‐chrome C、Caspase-9 的剪接體和激活型 Caspase-3 的表達(dá)量顯著升高，而各組間Bax 表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。

圖6 免疫印跡檢測ARA55 過表達(dá)后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變Fig.6 Changes of apoptosis-related proteins in response to ARA55 overexpression detected using immunob?lotting

3 討論

ARA55是最初從TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞中被鑒定發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，因此又稱為轉(zhuǎn)化生長因子 β1 誘導(dǎo)因子 1（transforming growth fac‐tor beta-1-induced transcript 1 protein，TGF-β1I1）［2］。ARA55屬于LIM 蛋白家族，蛋白結(jié)構(gòu)與樁蛋白（pax‐illin）家族高度同源。人類ARA55基因定位在16 號染色體（chr16：31，471，585-31，477，960；GRCh38/hg38），共含11個外顯子，ORF為1 386 bp，編碼的蛋白多肽含有461個氨基酸，分子量為55 kD。本研究將pCMV-ARA55-EGFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CNE2 細(xì)胞后，24 h 即可看到 EGFP 的表達(dá)，約 48 h 達(dá)到表達(dá)高峰，EGFP 的表達(dá)陽性率接近60%。因本研究插入的ARA55 全長cDNA 序列與EGFP 共用一個啟動子，故重組質(zhì)粒表達(dá)融合蛋白。本研究經(jīng)Western blot 進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可表達(dá)融合蛋白（ARA55-EGFP），說明重組質(zhì)粒可在CNE2 細(xì)胞中表達(dá)外源性ARA55蛋白。

目前，ARA55 在惡性腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)功能因腫瘤類型的不同而有差異。GULVADY 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，ARA55 在癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時的形態(tài)改變及可塑性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。有報道通過研究大腸癌的裸鼠種植瘤組織細(xì)胞和LoVo 大腸癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ARA55 的表達(dá)在癌細(xì)胞的成熟及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11］。QIAN 等［4］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者癌組織中高表達(dá)ARA55 蛋白，并且患者的預(yù)后受ARA55的表達(dá)峰度影響，蛋白表達(dá)越高，患者生存時間越短；當(dāng)下調(diào)PCCs 胰腺癌細(xì)胞中ARA55 的表達(dá)時，可觀察到細(xì)胞的生長增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯被抑制，細(xì)胞發(fā)生凋亡。同樣，有研究報道ARA55 在小鼠B16-F1 黑色素瘤細(xì)胞中也呈高表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)采用shRNA 沉默ARA55 表達(dá)后，細(xì)胞的生長增殖及侵襲遷移均受到不同程度的抑制［12］。在肝細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)，ARA55 的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［13］。因此，可推斷ARA55在某些腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。

盡管如此，有些研究認(rèn)為ARA55可能是發(fā)揮抑癌基因的作用。有研究顯示ARA55 在大腸癌組織的表達(dá)較癌旁組織低［14］。另外，前列腺癌患者癌組織中ARA55的平均表達(dá)峰度遠(yuǎn)低于癌旁組織；其進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中ARA55 表達(dá)越低的患者，腫瘤的分化程度越高；此外一些培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn) ARA55 呈表達(dá)下調(diào)或沉默狀態(tài)［3，15］。本研究在CNE2鼻咽癌細(xì)胞中上調(diào)外源性ARA55的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)CNE2 細(xì)胞的生長增殖和體外侵襲轉(zhuǎn)移能力均被不同程度地抑制或阻礙，提示ARA55在鼻咽癌（CNE2 細(xì)胞）中發(fā)揮抗癌基因的生物學(xué)作用。國內(nèi)有研究在大腸癌LoVo 細(xì)胞中上調(diào)外源性ARA55 后，也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［14］，本研究結(jié)果與之類似。

本研究進(jìn)一步探討了ARA55過表達(dá)對CEN2細(xì)胞凋亡的影響。因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE2 細(xì)胞含有EGFP，本研究用紅色熒光Annexin V-PE/7-AAD 雙色染料檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生率［9］。本研究發(fā)現(xiàn)外源性ARA55 表達(dá)上調(diào)后，CNE2 細(xì)胞凋亡率明顯升高。崔巍等［14］的研究也顯示，在大腸癌細(xì)胞中上調(diào)ARA55 后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。細(xì)胞發(fā)生凋亡后，可產(chǎn)生片段化的DNA［16-18］。本研究提取轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)ARA55過表達(dá)組細(xì)胞基因組DNA 發(fā)生片段化明顯。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)上調(diào)ARA55表達(dá)后，CNE2 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)，下游的Cytochrome C 蛋白的表達(dá)升高，Caspase-9 的剪接體及激活型Caspase-3（只檢測Asp175 剪切后產(chǎn)生的19 kD 和17 kD 的剪接體）表達(dá)均明顯升高。以上結(jié)果提示，ARA55 過表達(dá)可激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導(dǎo)CNE2 細(xì)胞凋亡，結(jié)果與文獻(xiàn)的報道基本一致［14］。

綜上所述，上調(diào)CNE2 中ARA55 表達(dá)可抑制細(xì)胞的生長增殖和體外侵襲轉(zhuǎn)移能力，并能夠激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。